ICS13.020CCSZ06江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T4539—2023淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測技術(shù)方法TechnicalmethodforenvironmentalDNAmonitoringoffreshwaterorganisms2023?09?22發(fā)布 2023?10?22實(shí)施江蘇省市場監(jiān)督管理局 發(fā) 布中國標(biāo)準(zhǔn)出版社 出 版DBDB32/T4539—2023DBDB32/T4539—2023ⅢⅢⅠⅠ目 次前言 Ⅲ范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1監(jiān)測點(diǎn)位布設(shè) 3監(jiān)測頻次與時間 4試劑和材料 4儀器和設(shè)備 5環(huán)境DNA宏條形碼監(jiān)測內(nèi)容和方法 5質(zhì)量控制與質(zhì)量保證 9廢棄物處理 10附錄資料）環(huán)境DNA固定劑 11附錄資料）常用淡水生物DNA條形碼擴(kuò)增引物信息 12附錄規(guī)范）淡水生物DNA條形碼構(gòu)建方法 14附錄資料）生物統(tǒng)計(jì)表 17附錄規(guī)范）野外質(zhì)量控制與保證 18附錄規(guī)范）實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制與保證 19參考文獻(xiàn) 21前 言本文件按照GB/T1.1—202標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)的規(guī)起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省生態(tài)環(huán)境廳提出并歸口。本文件起草單位：江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心、南京大學(xué)。DBDB32/T4539—2023DBDB32/T4539—2023PAGEPAGE20PAGEPAGE21淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測技術(shù)方法范圍本文件規(guī)定了利用環(huán)境DNA技術(shù)監(jiān)測淡水生物的采樣、試劑和材料、儀器和設(shè)備、監(jiān)測內(nèi)容和步驟，以及質(zhì)量控制與保證。本文件適用于生態(tài)環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域湖泊、水庫、溪流、河流、河口區(qū)等水域浮游植物、浮游動物、著生藻類、大型底棲無脊椎動物和魚類等淡水生物物種組成及相對豐度的監(jiān)測。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文包括所有的修改單適用于本文件。GB19489 實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求GB/T20001.4 標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4部分試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)GB/T29859 生物信息學(xué)術(shù)語GB/T30989 高通量基因測序技術(shù)規(guī)程GB/T34265 Sanger法測序技術(shù)指南GB/T35890 高通量測序數(shù)據(jù)序列格式規(guī)范GB/T37874 核酸提取純化方法評價(jià)通則GB/T40226 環(huán)境微生物宏基因組檢測 高通量測序法HJ91.2 地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)規(guī)范HJ494 水質(zhì) 采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ710.7 生物多樣性觀測技術(shù)導(dǎo)則 內(nèi)陸水域魚類HJ710.8 生物多樣性觀測技術(shù)導(dǎo)則 淡水底棲大型無脊椎動物HJ1216 水質(zhì) 浮游植物的測定 0.1ml計(jì)數(shù)框?顯微鏡計(jì)數(shù)法HJ1295 水生態(tài)監(jiān)測技術(shù)指南 河流水生生物監(jiān)測與評試）HJ1296 水生態(tài)監(jiān)測技術(shù)指南 湖泊和水庫水生生物監(jiān)測與評試）SC/T9402 淡水浮游生物調(diào)查技術(shù)規(guī)范SN/T4835 實(shí)驗(yàn)室生物廢棄物管理要求DB21/T2777 海洋浮游微藻分離和篩選技術(shù)規(guī)程DB32/T4178 河流水生態(tài)監(jiān)測規(guī)范術(shù)語和定義GB/T20001.4GB/T29859GB/T30989界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1淡水生物 freshwaterorganisms生活在各類淡水生境中的生物。注：主要的淡水生物類群包括浮游植物、浮游動物、大型底棲無脊椎動物和魚類等。3.2環(huán)境DNA environmentalDNAeDNA或混合生物組織中存在的脫氧核糖核酸等生物遺傳物質(zhì)。3.3DNA條形碼 DNAbarcode生物體細(xì)胞核或者細(xì)胞器中能夠代表該物種的DNA序列，可用于物種的識別和鑒定。[SN/T4278—20153.1]3.4引物 primer在DNA復(fù)制過程中，結(jié)合于模板鏈上并提供DNA合成起點(diǎn)，具有一定長度和順序的寡核苷酸鏈。3.5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerasechainreactionPCR一種體外酶促合成特異DNA片段的分子技術(shù)，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等組成一個周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便省時等特點(diǎn)。3.6Sanger測序 Sangersequencing用于基因測序的雙脫氧末端終止法，在鏈延伸過程中利用熒光標(biāo)記雙脫氧堿基隨機(jī)阻斷，產(chǎn)生以A/T/G/C結(jié)束的四組不同長度的核苷酸鏈，通過讀取熒光信號實(shí)現(xiàn)對核酸堿基序列信息的讀取。3.7遺傳距離 geneticdistance群或分類單元間的遺傳差異程度，可以通過遺傳標(biāo)記如DNA條形碼的序列差異來表示。3.8高通量測序 high?throughputsequencing區(qū)別于傳統(tǒng)雙脫氧鏈末端終止法測序，能夠一次并行對大量核酸分子進(jìn)行平行序列測定的技術(shù)。[GB/T30989—20143.19]3.916S核糖體 DNA 16SribosomalDNA16SrDNA原核生物編碼核糖體小亞基rRNA的DNA序列。3.1018S核糖體 DNA 18SribosomalDNA18SrDNA真核生物編碼核糖體小亞基rRNA的DNA序列。3.11線粒體12S核糖體DNA mitochondrial12SribosomalDNAMt12SrDNA后生動物線粒體編碼12SrRNA的DNA序列。3.12線粒體細(xì)胞色素c氧化酶I mitochondrialcytochromecoxidaseICOI后生動物線粒體編碼細(xì)胞色素c氧化酶I的DNA序列。3.13DNA宏條形碼 DNAmetabarcoding利用高通量測序獲取環(huán)境DNA中特定的DNA片段，根據(jù)DNA序列差異識別物種，獲取物種組成和群落結(jié)構(gòu)。3.14標(biāo)簽 tag通過PCR或文庫準(zhǔn)備過程中為每個樣品添加一個短序列的核苷酸堿基對，允許多個樣品在一個高通量測序運(yùn)行中被匯集。注：這個序列對于同一個運(yùn)行中的每個樣本都是不同的，并使序列能夠在測序后分配回它們來自的樣本。3.15序列相似性 sequencesimilarity反映序列間相似程度的數(shù)值，即序列間相同DNA堿基數(shù)目所占的比例。注：一般以百分?jǐn)?shù)表示。[SN/T4278—20153.8]3.16序列相似性閾值 cutoffvalueofsequencesimilarity判定兩條DNA序列是否為同一分類單元的最小序列相似值。3.17擴(kuò)增序列變體 ampliconsequencevariantsASVDNA宏條形碼技術(shù)中，通過生物信息學(xué)剔除PCR擴(kuò)增和測序產(chǎn)生的錯誤序列后形成的獨(dú)特DNA序列，即任意兩條序列間至少有一個堿基存在差異。3.18操作分類單元 operationaltaxonomicunitOTUDNA宏條形碼測序數(shù)據(jù)按照一定的序列相似性閾值進(jìn)行聚類，獲得的用于表征物種的分子水平分類單元。3.19相對豐度 relativeabundance樣品中分配到某一分類單元的序列數(shù)占該樣品序列總數(shù)的比例。[GB/T40226—20213.2]3.20陰性質(zhì)控樣本 negativecontrolsample確定不含特定物種或者所有物種的樣本例如無菌水，與待測樣本同步試驗(yàn)，用于判斷待測樣本是否被污染。3.21陽性質(zhì)控樣本 positivecontrolsample已確定物種組成的樣本，與待測樣本同步試驗(yàn)，用于判斷測序結(jié)果是否可靠。監(jiān)測點(diǎn)位布設(shè)通則按照HJ91.2設(shè)置環(huán)境DNA采樣點(diǎn)位，應(yīng)遵循連續(xù)性、一致性、代表性和可行性原則。結(jié)合環(huán)境DNA質(zhì)、溫度、水文和水化學(xué)等因素的影響。注：生活污水中可能含有殘留的生物DNA溪流、河流點(diǎn)位布設(shè)按照HJ1295的規(guī)定設(shè)置監(jiān)測斷面，每個斷面設(shè)置不少于3個代表性點(diǎn)位。在緩慢流動的低地溪流和河流中，宜間隔1km設(shè)置采樣點(diǎn)。在快速流動的高山溪流和河流中，采樣位點(diǎn)宜間隔10km以上。應(yīng)詳實(shí)記錄河流的地形特征pH值等影響環(huán)境DNA擴(kuò)散的因素。湖泊、水庫監(jiān)測點(diǎn)位布設(shè)按照HJ1296的規(guī)定設(shè)置監(jiān)測點(diǎn)位，大型湖泊應(yīng)適當(dāng)增加監(jiān)測點(diǎn)位。湖庫構(gòu)成湖庫群，當(dāng)對區(qū)域湖庫作整體監(jiān)測時，可適當(dāng)減少單個湖庫的監(jiān)測點(diǎn)位。宜設(shè)置湖庫監(jiān)測點(diǎn)位周邊100m的范圍內(nèi)為采樣區(qū)域。深水型湖泊宜間隔5m深度分層采樣。監(jiān)測頻次與時間監(jiān)測頻次綜合考慮水域環(huán)境條件、生物類群的時空分布特點(diǎn)、監(jiān)測目的及人力、費(fèi)用投入，確定監(jiān)測頻次?？蛇x擇季度或月度開展監(jiān)測，應(yīng)避開雨水集中的時間。針對重點(diǎn)關(guān)注區(qū)域、突發(fā)環(huán)境問題或其他條件下，可開展更高頻次的監(jiān)測。監(jiān)測時間采樣時間宜綜合考慮靶向監(jiān)測類群的生態(tài)特征和生活史及水體類型。例如如魚類洄游。試劑和材料超純水。分析純無水乙醇。環(huán)境DNA固定劑，可參考附錄A。DNA提取試劑盒或CTAB法提取DNA所用到的試劑。PCR擴(kuò)增試劑：用于特異性片段PCRPCR擴(kuò)增引物：可參考附錄B。PCR產(chǎn)物純化試劑盒：用于PCR產(chǎn)物純化。DNA濃度測定試劑：用于DNA濃度測定，主要成分包括緩沖液和染色劑。凝膠電泳相關(guān)試劑：用于PCR標(biāo)記。DNA連接無菌采樣瓶或采樣袋：1L及以上規(guī)格。無菌微孔濾膜：0.22μm0.45μm1.2μm和5μm等。無菌鑷子。1.5mL2mL10mLDNA和生物殘留。5mLDNA和生物殘留。10μL200μL1000μL和5mLDNA和生物殘留。PCR96孔板等類似的PCRDNA和生物殘留。無菌手套。儀器和設(shè)備恒溫水浴鍋。渦旋振蕩器或均質(zhì)儀。冷凍干燥儀。真空離心濃縮儀。高速冷凍離心機(jī)：離心轉(zhuǎn)速可達(dá)13000r/min4℃。0.5μL~10μL20μL~200μL和100μL~1000μL等。超微量分光光度計(jì)：測量體積最小1μL230nm260nm和280nm。PCR儀。電子天平。水平式核酸電泳儀。凝膠成像分析儀。高通量測序儀。高溫高壓滅菌器：可達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求的121℃21min滅菌條件。2L或5L。25號浮游動物網(wǎng)，孔徑64μm。大型底棲無脊椎動物采集裝置D水樣抽濾設(shè)備：具備-91.2kPa以上的真空抽濾設(shè)備。大型底棲無脊椎動物清洗裝置40目篩網(wǎng)等。超凈工作臺。低溫存儲設(shè)備：普通冰箱、低溫冰箱和超低溫冰箱。液氮罐。工作站：運(yùn)行內(nèi)存不低于16GB1TB8核。高通量測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和分析軟件。環(huán)境DNA宏條形碼監(jiān)測內(nèi)容和方法環(huán)境DNA宏條形碼監(jiān)測內(nèi)容環(huán)境DNA宏條形碼監(jiān)測包括環(huán)境DNA樣品采集、環(huán)境DNA提取、宏條形碼擴(kuò)增與測序、生物信息學(xué)分析、生物統(tǒng)計(jì)表和質(zhì)量控制與質(zhì)量保證等過程（見圖1）。圖1 環(huán)境DNA宏條形碼監(jiān)測技術(shù)流程環(huán)境DNA樣品采集通則根據(jù)監(jiān)測的生物類群，按照表1選擇合適的環(huán)境DNA采集方法，每個位點(diǎn)采集3個生物重復(fù)樣品。表1 不同生物類群的環(huán)境DNA采樣介質(zhì)生物類群水樣沉積物生物膜混合生物組織浮游植物++++著生藻類+++++浮游動物++++++a大型底棲無脊椎動物+++++++b魚類++++注：+++表示較多采用，+++表示最為常用。a浮游動物主要通過浮游生物網(wǎng)收集組織DNA。b大型底棲無脊椎動物主要通過采集沉積物中底棲動物組織，進(jìn)一步通過乙醇浸提法獲取組織DNA。水樣水樣采集按照HJ494的規(guī)定執(zhí)行，采樣體積不宜小于1L。浮游植物監(jiān)測的水樣體積宜為1L棲動物和魚類監(jiān)測的水樣體積宜為3L?，F(xiàn)場過濾至一定孔徑一般為0.45的濾膜上，高泥沙水樣，℃或冰袋保存靜置分離懸浮顆粒物，再過濾。生物密度較高的水體如處于藻華爆發(fā)期將水樣等體積分開過濾至多張1~濾膜作為子樣本。野外干冰-20℃-20℃以下保存；或者加入附錄A推薦的固定劑，常溫保存。沉積物樣品按照HJ494的規(guī)定采集50mL的表層沉積物0cm~5c積生物殘?bào)w，收集至無菌管中，同一采樣點(diǎn)沉積物采集宜涵蓋各類小生境如沉水植被覆蓋區(qū)等。野外干冰或-20℃保存，實(shí)驗(yàn)室-20℃保存；或者加入無水乙醇，確保樣品中最終的乙醇濃度≥80%保存。生物膜樣品按照DB32/T4178的規(guī)定從不同自然基質(zhì)如粗礫石、鵝卵石以及樹木殘干等表面刮取25cm2樣品，無菌水清洗至采樣瓶中，野外干冰或-20℃保存，實(shí)驗(yàn)室-20℃保存；或者加入無水乙醇，確保最終的乙醇體積分?jǐn)?shù)≥80%混合生物組織樣品按照SC/T9402的規(guī)定用浮游生物網(wǎng)定量采集浮游動物樣品，采樣體積不小于20L5μm-20℃保存；或者加入附錄A推薦的固定劑，常溫保存。大型底棲無脊椎動物采集與篩選應(yīng)按照HJ710.83倍體積的無水乙醇，1g換算為1mL，常溫保存。環(huán)境DNA樣品前處理水樣/混合浮游動物組織樣品：利用研磨珠和裂解液將濾膜振蕩破碎。沉積物樣品：乙醇保存的樣品應(yīng)高速不低于12000r/min離心20min，留取沉淀物。低溫保存的樣品可經(jīng)均質(zhì)儀均質(zhì)后冷凍干燥生物膜樣品：4℃2mL不低于12000r/mi離心20min淀物?；旌系讞珓游锝M織樣品5d，多次振蕩混勻，吸取浸出液，真空離心濃縮至乙醇完全去除。環(huán)境DNA提取DNA提取按照GB/T40226中的操作步驟，借助物理和化學(xué)方法充分釋放環(huán)境介質(zhì)中蘊(yùn)含的DNA，并去除樣品中的蛋白質(zhì)、脂類、多糖、RNA等雜質(zhì)，采用離心柱法和磁珠法等常規(guī)分子生物學(xué)操作純化DNA。DNA濃度測定與保存樣本DNA質(zhì)量濃度應(yīng)不低于1ng/μL10ng/μL~100ng/μL260nm和280nm波長處的吸光度值比值OD260nm/OD280n應(yīng)在1.7~2.0OD260nm/OD230nm應(yīng)大于2.0。DNA平行—20℃及以下溫度條件保存，避免反復(fù)凍融。宏條形碼擴(kuò)增與測序宏條形碼擴(kuò)增針對不同生物類群選擇特異性一對或多對引物擴(kuò)增目標(biāo)條形碼序列，可在引物序列前添加標(biāo)簽以區(qū)分樣品。推薦引物參照附錄B。宏條形碼產(chǎn)物用1%~2的瓊脂糖凝膠電泳檢測，應(yīng)呈現(xiàn)單一清晰明亮、無拖尾的條帶。若樣品出現(xiàn)多個條帶，需純化PCR產(chǎn)物，純化過程參考SN/T4278。條形碼擴(kuò)增產(chǎn)物在-20℃及以下保存，保存時間一般不超過1年。高通量測序宜將含有不同的引物標(biāo)簽的宏條形碼擴(kuò)增產(chǎn)物等摩爾量混合構(gòu)建測序文庫。文庫構(gòu)建起始量應(yīng)不低于100ng。當(dāng)文庫的片段長度分布符合預(yù)期將多個質(zhì)檢合格的文庫按比例混合GB/T30989和GB/T35537對宏條形碼擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。同一試驗(yàn)樣本宜安排在同一批次上機(jī)測序。每個樣本的預(yù)期的有效序列數(shù)不宜低于30000條。生物信息學(xué)分析一般要求同一批試驗(yàn)數(shù)據(jù)，生物信息學(xué)分析流程及關(guān)鍵參數(shù)應(yīng)保持一致。序列質(zhì)量控制雙端測序應(yīng)進(jìn)行序列合并。通過搜索特定序列去除測序接頭adaptortag和引物于堿基識別質(zhì)量>Q20和序列長度>預(yù)期長度的70%進(jìn)行序列修剪，確保前端序列長度+后端序列長度?兩段序列的重疊長度目標(biāo)序列長度。文庫拆分根據(jù)每個樣品的標(biāo)簽將序列分配到不同的樣品中。序列聚類及質(zhì)量控制可選用OTU或ASV方法進(jìn)行序列聚類和或降噪OTU方法：將相似性大于或等于閾值相似性閾值一般為97的序列合并成OTUs對到每個OTU的代表性序列，獲得每個OTU在每個樣品中出現(xiàn)的序列數(shù)。ASV方法：每個獨(dú)特的序列即為一個ASV，根據(jù)生物信息學(xué)方法過濾潛在的PCR和測序錯誤的ASV序列，將序列比對到每個ASVASV在每個樣品中出現(xiàn)的序列數(shù)。過濾低豐度的分子分類單元過濾低豐度如總序列數(shù)為1~5，可能為假陽性、污染序列或未去除的嵌合體和陰性對照中相對序列豐度超過千分之一的分子分類單元，也可根據(jù)實(shí)際監(jiān)測需求調(diào)整過濾的豐度閾值。注：嵌合體為PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生的由兩種或兩種以上序列母體組合的錯誤序列。物種注釋將分子分類單元的序列與條形碼數(shù)據(jù)庫比對分析，獲得物種注釋信息。物種注釋方法和物種鑒定閾主要是序列相似性的選擇，宜綜合考慮選用的條形碼片段、參考數(shù)據(jù)庫的完整性及數(shù)據(jù)用途。當(dāng)參考數(shù)據(jù)庫中不存在目標(biāo)物種的DNAC構(gòu)建DNA條形碼。結(jié)果統(tǒng)計(jì)檢出判定分子分類單元在某一位點(diǎn)的生物重復(fù)樣品中檢出率物種檢出的樣品數(shù)除以總樣品數(shù)不應(yīng)低于2/3。建議每個樣品宜保留相對豐度>0.01%，出現(xiàn)在兩個樣點(diǎn)以上的分子分類單元。序列相對豐度每個位點(diǎn)檢出的分子分類單元的序列相對豐度應(yīng)為所有生物重復(fù)樣品中序列相對豐度的平均值。針對相對豐度差異較大的生物重復(fù)，宜取幾何平均數(shù)。生物統(tǒng)計(jì)表每個樣品的生物多樣性統(tǒng)計(jì)表由分子分類單元（如ASVs或OTUs）名稱、序列、物種注釋信息、序列數(shù)和相對豐度組成，可參考附錄D。質(zhì)量控制與質(zhì)量保證質(zhì)量控制質(zhì)量控制參數(shù)陰性對照在每天的樣品采集、同一批次DNA提取和PCR擴(kuò)增階段應(yīng)分別設(shè)置不少于3個陰性對照，高通量測序時可適當(dāng)設(shè)置1~3個測序的陰性對照（見表2）。表2 環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)每個流程設(shè)置的陰性和陽性對照操作過程陰性質(zhì)控樣本陽性質(zhì)控樣本過濾無菌水無DNA提取無菌水已知組成的混合群落PCR擴(kuò)增無菌水已知物種組成的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品測序無菌水測序試劑盒中的對照試劑陽性對照宜設(shè)置不少于6個PCR擴(kuò)增的陽性對照。PCR擴(kuò)增的陽性對照應(yīng)為不少于5個物種的基因組已知可以有效擴(kuò)增的等量混合物，質(zhì)量濃度一般為1ng/μL。也可根據(jù)試驗(yàn)需要和試驗(yàn)條件在DNA提取和測序過程中適當(dāng)設(shè)置陽性對照見表。平行樣品每個位點(diǎn)應(yīng)設(shè)置至少3個生物重復(fù)樣品，可根據(jù)試驗(yàn)需求和試驗(yàn)條件適當(dāng)設(shè)置DNA提取、PCR和建庫測序平行樣品。平行樣品的相對豐度取平均值作為位點(diǎn)的相對豐度。質(zhì)量控制評價(jià)指標(biāo)假陰性率使用PCR擴(kuò)增的陽性對照評估監(jiān)測的假陰性率。重復(fù)測定6次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)樣品中含有但測量結(jié)果中未檢出的物種所占比例，即假陰性率（FN）。假陰性率不應(yīng)超過10%。按照公式（1）計(jì)算。FN=n1n （1）式中：FN——假陰性率；n1——標(biāo)準(zhǔn)樣品中未被測出的物種數(shù)目，單位為個；n ——標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)際物種數(shù)目假陽性率使用PCR擴(kuò)增的陽性對照評估監(jiān)測的假陽性率。重復(fù)測定6次，計(jì)算測量結(jié)果的中標(biāo)準(zhǔn)樣品中未包含物種的出現(xiàn)概率，即假陽性率（FP）。假陽性率不應(yīng)超過10%。按照公式（2）計(jì)算。FP=n2n （1）式中：FP——假陽性率；n2——未在標(biāo)準(zhǔn)樣品物種清單的物種數(shù)目，單位為個；n——標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)際物種數(shù)目，單位為個。質(zhì)量保證野外質(zhì)量保證按照附錄E的規(guī)定做好野外樣品采集、運(yùn)輸與保存，防止樣品的交叉污染。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證試驗(yàn)過程應(yīng)防止樣品的污染，并按照附錄F的規(guī)定做好數(shù)據(jù)記錄和樣品保存。廢棄物處理廢棄物的分類、收集、存放和集中處理應(yīng)按照GB19489和SN/T4835的規(guī)定執(zhí)行，其中生物廢棄物在處理之前應(yīng)采用高壓滅菌、消毒或灼燒等方式滅活，對含核酸染料的廢液和廢膠單獨(dú)收集和處理。附 錄 A資料性）環(huán)境DNA固定劑乙醇固定劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)不小于96%，且其中不含甲醇等其他醇類。固定劑需浸沒整個樣本，樣本在乙醇中可以在常溫下穩(wěn)定儲存3個月~6個月。乙醇保存樣本不可在—10℃以下儲存。Longmires固定劑Longmires固定劑應(yīng)浸沒整個樣本。常溫下Longmires中可以穩(wěn)定儲存2周~6周。Long?mires固定劑在低溫下可能會出現(xiàn)沉淀，可適當(dāng)加熱待沉淀溶解再使用。Longmires固定劑配方見表A.1。表A.1 Longmires固定劑配方序號成分濃度體積1Tris?HCl1mol/L100mL2EDTA0.5mol/L200mL3NaCl4mol/L2.5mL4SDS—5g定容雙蒸水—1L附 錄 B資料性）常用淡水生物DNA條形碼擴(kuò)增引物信息常用淡水生物DNA條形碼擴(kuò)增引物信息如表B.1所列。表B.1 常用淡水生物DNA條形碼擴(kuò)增引物信息目標(biāo)群落基因名稱引物名稱5~3）預(yù)期長度bp退火溫度℃藍(lán)藻門16S_V316S_341FACCTACGGGRSGCWGCAG100~20055~6216S_518RATTACCGCGGCTGCTGG16S_V416S_515FGTGCCAGCMGCCGCGGTAA~30055~6216S_806RGGACTACHVGGGTWTCTAAT16S_V3_V416S_338FACTCCTACGGGAGGCAGCAG400~50055~6216S_806RGGACTACHVGGGTWTCTAAT23Sp23SrV_f1GGACAGAAAGACCCTATGAA400~45049~52p23SrV_r1TCAGCCTGTTATCCCTAGAG真核藻類18S_V918S_1389FTCCCTGCCHTTTGTACACAC100~20055~6218S_1510RCCTTCYGCAGGTTCACCTAC18S_V4TAReuk454FWD1CCAGCASCYGCGGTAATTCC300~40055~62TAReukREV3ACTTTCGTTCTTGATYRA著生硅藻18S_V4DIV4_FGCGGTAATTCCAGCTCCAATAG400~50048~55DIV4_RCTCTGACAATGGAATACGAATA浮游動物大型底棲無脊椎動物COI?1mlCOIintFGGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC~31345~55dgHCO2198TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA大型底棲無脊椎動物COI?2mlCOIintFGGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC~31345~55jgHCO2198TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA魚類Mt12SrD?NA?1MetafishF1TCGTGCCAGCCACCGCGGTTA150~20060~63MetafishR1ATAGTGGGGTATCTAATCCCAGMt12SrD?NA?2Teleo_FACACCGCCCGTCACTCT~10055~60Teleo_RCTTCCGGTACACTTACCATGMt12SrD?NA?3Tele02_FAAACTCGTGCCAGCCACC150~20055~60Tele02_RGGGTATCTAATCCCAGTTTG表B.1 常用淡水生物DNA條形碼擴(kuò)增引物信息（續(xù)）目標(biāo)群落基因名稱引物名稱5~3）預(yù)期長度bp退火溫度℃魚類Mt12SrD?NA?4Mifish_U_FGTCGGTAAAACTCGTGCCAGC150~20055~60Mifish_U_RCATAGTGGGGTATCTA?ATCCCAGTTTGMt16SrD?NAFish16S_FGGTCGCCCCAACCRAAG~10055~60Fish16S_RCGAGAAGACCCTWTGGAGCTTIAG簡并堿基代碼：MA/VA/C/RA/HA/C/WA/DA/G/SC/BC/G/YC/NA/G/C/KG/。附 錄 C規(guī)范性）淡水生物DNA條形碼構(gòu)建方法DNA條形碼構(gòu)建流程當(dāng)參考數(shù)據(jù)庫中不存在目標(biāo)物種的DNA序列時，按照本附錄構(gòu)建DNA條形碼。水生生物DNA條形碼構(gòu)建流程主要包括物種鑒定、條形碼擴(kuò)增與測序、條形碼評估和條形碼入庫等過程。樣品采集和物種鑒定浮游植物的定性樣品采集、保存與鑒定應(yīng)按照HJ1216的規(guī)定執(zhí)行，浮游植物的分離培養(yǎng)按照DB21/T2777的規(guī)定執(zhí)行。浮游動物的定性樣品采集與鑒定應(yīng)按照SC/T9402的規(guī)定執(zhí)行，加乙醇溶液固定乙醇體積分?jǐn)?shù)≥90大型底棲無脊椎動物的定性樣品采集與鑒定應(yīng)按照HJ710.8的規(guī)定執(zhí)行，加乙醇溶液固定乙醇體積分?jǐn)?shù)≥90魚類樣品采集與鑒定應(yīng)按照HJ710.7的規(guī)定執(zhí)行，野外干冰或-20℃保存，實(shí)驗(yàn)室-20℃保存；或加乙醇溶液固定乙醇體積分?jǐn)?shù)≥90浮游動物、大型底棲無脊椎動物和魚類的每個物種個體數(shù)不宜少于5，浮游植物和著生藻類的純培養(yǎng)藻種樣品數(shù)不宜少于5個。形態(tài)學(xué)鑒定應(yīng)由三名具有豐富鑒定經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員獨(dú)立完成后匯總保留憑證標(biāo)本。條形碼擴(kuò)增與測序DNA提取和濃度及純度測定常用DNA提取方法包括離心柱法和磁珠法。選取完整個體或合適部位的組織提取DNA外源污染。植物和動物組織DNA的提取分別參考LY/T3191和SN/T4278。按GB/T37874的規(guī)定評價(jià)提取的DNA濃度和純度，一般要求濃度不低于1ng/μL260nm和280nm波長處的吸光度值比值OD260nm/OD280n應(yīng)在1.7~1.9OD260nm/OD230nm應(yīng)>2.0。有效的DNA樣品分裝為兩份，一份在-80℃長期保存，另一份保存在-20℃用于后續(xù)試驗(yàn)，避免反復(fù)凍融。條形碼擴(kuò)增與檢測C.3.2.2針對不同生物類群選擇引物擴(kuò)增目標(biāo)DNA條形碼序列，常用PCR擴(kuò)增引物和擴(kuò)增反應(yīng)條件參照表B.1。C.3.2.2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%~2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增的有效性，應(yīng)在目標(biāo)長度位置出現(xiàn)一條單一的條帶。若樣品出現(xiàn)多個條帶，需純化PCR產(chǎn)物。具體過程參考SN/T4278。測序使用Sanger法測序儀或第二代高通量測序儀對目標(biāo)條帶進(jìn)行測序。為減少Sanger法測序出現(xiàn)雙峰或者測序失敗，可以先將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中再進(jìn)行測序。第二代高通量測序可為每個樣本提供不少于1000條高質(zhì)量序列。Sanger法測序要求參考GB/T34265，高通量測序要求參考GB/T30989和GB/T35537。條形碼評估序列質(zhì)量控制將一代測序雙端測序文件進(jìn)行拼接GB/T34265去除測序結(jié)果兩端的低質(zhì)量序列應(yīng)與PCR擴(kuò)增正向引物方向一致。第二代高通量測序通常保留數(shù)量最多的序列列方向與PCR擴(kuò)增正向引物方向一致。Sanger測序和高通量測序分別達(dá)到QV20和Q20。遺傳距離分析將有效的樣本序列合并整理成FASTA格式的文件，采用ClustalWMuscle等方法進(jìn)行多序列核苷酸或氨基酸密碼子比對，檢查蛋白編碼基因是否存在終止密碼子，并修剪對齊雙端序列。遺傳距離計(jì)算基于有差異的核苷酸位點(diǎn)在序列中所占的比例，同時需要考慮4種核苷酸的發(fā)生頻率和核苷酸替換類型。遺傳距離計(jì)算模型包括pJukes?Cantor模型和Kimura模型，一般采用K2P模型。p距離模型：利用兩個同源基因DNA序列間的核苷酸差異數(shù)所占的比例來表示基因間的分歧度。Jukes?Cantor模型：本模型假定4種核苷酸之間相互隨機(jī)替代，即某一核苷酸替代變成其他3種核苷酸的概率是等同的。Kimura兩參數(shù)模型：本模型將核苷酸替代分成轉(zhuǎn)換替代和顛換替代，其中轉(zhuǎn)換指AG間替代或TC間替代。顛換指A和T/C間的替代或G和T/C間的替代。根據(jù)實(shí)際監(jiān)測數(shù)據(jù)，核苷酸的轉(zhuǎn)換替代率約為顛換替代率的2倍，該方法可以更加真實(shí)地反映核苷酸序列間的差異。條形碼有效性成功的物種條形碼應(yīng)同時滿足以下條件：陰性對照PCR無條帶；陽性對照的PCR產(chǎn)物在預(yù)期的DNA條形碼序列長度位置出現(xiàn)目的條帶；同一個樣本Sanger測序獲得的序列相似性≥99%；同一個樣本高通量測序獲得的第一優(yōu)勢序列占比≥90%；種內(nèi)遺傳距離明顯小于種間距離5~10。物種條形碼入庫成功的物種條形碼相關(guān)信息導(dǎo)入DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。DNA條形碼由樣本信息、DNA條形碼信息、分類信息構(gòu)成。樣本信息庫包括完整的樣本采集和鑒定信息分類信息、鑒定者、數(shù)張樣本照片等。DNA條形碼信息包括每個樣本擴(kuò)增采用的引物DNA序列及基本信息統(tǒng)計(jì)。DNA條形碼信息表格可參考表C.1。表C.1 DNA條形碼信息表樣本編號樣本照片采樣位點(diǎn)采樣人/單位采樣時間經(jīng)緯度海拔溫度鑒定人/單位鑒定時間分類特征中文名拉丁名分類信息（門綱目科屬種）DNA條形碼引物信息□16S□18S□COI□線粒體12S□其他：GC含量序列長度測序平臺序列序列原始峰圖質(zhì)量控制和安全管理嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行信息采集包括數(shù)據(jù)記錄表和數(shù)碼圖片等。的所有信息抄寫在實(shí)驗(yàn)室樣品登記表上，按照采樣區(qū)域或樣點(diǎn)對樣品登記表進(jìn)行統(tǒng)一編號。試驗(yàn)場所應(yīng)具備分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基本條件。75乙醇擦洗表面。DNA提取陰性對照negativeisolationcontrolNIDNA提取過程中的污染：在DNA提取過程中設(shè)置一個空管，和樣品同步操作。PCR擴(kuò)增陰性對照negativeamplificationcontrolNAPCR反應(yīng)混合物制備過程中由于污染造成的假陽性DNA樣品進(jìn)行同步PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增效率的陽性對照positiveamplificationcontrolPA：添加等體積已知濃度的靶向生物的基因組DNAPCR擴(kuò)增。附 錄 D資料性）生物統(tǒng)計(jì)表淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測生物統(tǒng)計(jì)表見表D.1。表D.1 淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測生物統(tǒng)計(jì)表檢測單位點(diǎn)位名稱樣品采集日期樣品處理日期測序日期測序引物分子分類單元編號序列門綱目科屬種序列數(shù)相對豐度附 錄 E規(guī)范性）野外質(zhì)量控制與保證樣品的采集制定合理的采樣操作程序保證所有野外設(shè)備處于良好的運(yùn)行狀態(tài)/或校準(zhǔn)的計(jì)劃，以確保野外數(shù)據(jù)的異質(zhì)性和質(zhì)量。合理安排各類生物樣品采集順序，盡量避免生物類群在采集前受到較大擾動。及時在現(xiàn)場處理樣品。受生物活動影響，隨時間變化明顯的項(xiàng)目應(yīng)在規(guī)定時間內(nèi)測定。水樣采集后應(yīng)選用冰袋或4℃12h內(nèi)完成過濾。整個采樣和前處理過程應(yīng)保持無外源污染，并符合以下要求。應(yīng)全程佩戴無菌實(shí)驗(yàn)手套，采集下一個樣品應(yīng)及時更換手套。建議佩戴口罩。采樣和前處理過程宜采用一次性無菌裝置或耗材。對于重復(fù)使用裝置和耗材1.5%的次氯酸鈉消毒不少于1min。重復(fù)使用的采樣瓶，應(yīng)浸泡在1.5%的次氯酸鈉中不少于5min，用蒸餾水重復(fù)沖洗3干。在采樣點(diǎn)，再次用水樣沖洗三次，在采集樣品前應(yīng)除去任何殘留的次氯酸鈉。確保清洗后丟棄的水樣未與待取的水樣混合。應(yīng)只從外部接觸采樣瓶，不應(yīng)接觸采樣瓶及瓶蓋內(nèi)部。如果有必要進(jìn)入水中采樣，應(yīng)使用膠靴，并在采樣點(diǎn)之間進(jìn)行消毒。清除鞋底和靴子兩側(cè)的所有污垢、鵝卵石和其他環(huán)境碎屑。過濾每個位點(diǎn)的水樣前，過濾器接觸面應(yīng)使用漂白劑消毒不少于1min，并用蒸餾水反復(fù)沖3次。采樣記錄完整性。樣品的運(yùn)輸應(yīng)根據(jù)采樣記錄或登記表核對清點(diǎn)樣品，以免有誤或丟失。樣品運(yùn)輸中貯存溫度不超過采樣時的溫度，必要時需準(zhǔn)備冷藏設(shè)備。運(yùn)輸中應(yīng)仔細(xì)保管樣品不同介質(zhì)來源的環(huán)境DNA樣品應(yīng)單獨(dú)保存運(yùn)輸。樣品的運(yùn)輸盡量迅速。附 錄 F規(guī)范性）實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制與保證實(shí)驗(yàn)室要求DNA提取實(shí)驗(yàn)室和PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在物理空間上相互獨(dú)立，不應(yīng)有空氣的直接相通。PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備紫外線超凈工作臺。每個實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備專用的實(shí)驗(yàn)工作服基本操作要求實(shí)驗(yàn)人員不應(yīng)在同一天進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。確保所有儀器和設(shè)備處于良好的工作狀態(tài)如PCR應(yīng)進(jìn)行定期校準(zhǔn)和維護(hù)。確保所有的試驗(yàn)耗材和試劑在保質(zhì)期內(nèi)pH值下，可適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行高壓蒸汽滅菌。PCR應(yīng)進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。試驗(yàn)操作前，應(yīng)用1.5的消毒劑擦拭桌面，用75乙醇消毒雙手，用1.5的消毒劑消毒實(shí)驗(yàn)儀器。試驗(yàn)操作前，移液槍應(yīng)選用75%的酒精消毒或紫外線消毒30min。試驗(yàn)過程中，移液槍不應(yīng)接觸任何盛放樣品或試劑的容器內(nèi)壁。1.5mL不應(yīng)重復(fù)接觸來自不同樣品的試驗(yàn)材料。懷疑或確定產(chǎn)生交叉污染的樣品環(huán)境DNA提取1.5的漂白劑擦拭桌面。DNA提取應(yīng)全程佩戴口罩，防止刺激性氣味和交叉污染。沉積物稱量和轉(zhuǎn)移宜選用一次性無菌稱量匙。同一批次試驗(yàn)應(yīng)最后處理陽性對照樣品。準(zhǔn)確記錄陰性對照、陽性對照和試驗(yàn)樣品的DNA濃度和質(zhì)量。應(yīng)按照要求對DNA樣品進(jìn)行分裝和保存。環(huán)境DNA陰性對照、陽性對照和樣品的DNA應(yīng)分開保存，在物理空間上相互獨(dú)立?？杀４嬖诓煌?，若條件有限，可保存在冰箱的不同分層。宏條形碼擴(kuò)增與保存PCR反應(yīng)宜在紫外線超凈工作臺中進(jìn)行。紫外線超凈工作臺使用前30min。原始測序數(shù)據(jù)應(yīng)按照GB/T35890的規(guī)定保存為FASTQ文件，并準(zhǔn)確記錄測序數(shù)據(jù)的樣品來源、編號、擴(kuò)增引物和對應(yīng)的標(biāo)簽信息等。生物信息學(xué)分析陰性對照中的序列數(shù)應(yīng)小于樣品平均序列數(shù)的10%，并剔除樣品中包含的陰性對照序列。生物信息分析產(chǎn)生的數(shù)據(jù)應(yīng)妥善存儲，并按照要求記錄保存位置。數(shù)據(jù)記錄詳細(xì)準(zhǔn)確記錄樣品信息、操作人、試驗(yàn)數(shù)據(jù)及關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)室主管應(yīng)檢查所有數(shù)據(jù)記錄的正確性和完整性。數(shù)據(jù)記錄表應(yīng)有記錄人、校對人簽字。如果數(shù)據(jù)是以電子方式保存的，則數(shù)據(jù)應(yīng)定期備份。樣品保存1周檢查固定液，必要時進(jìn)行添加