基于納米通道的牛血清白蛋白在化學(xué)鍍的修飾中的電流響應(yīng)

1金納米通道的修飾作為納米技術(shù)的一部分，納米通道技術(shù)在分析和分析生物材料（如蛋白質(zhì)和核酸）方面發(fā)揮著重要作用，對生物模擬具有重要意義。金納米通道作為人工合成的納米通道之一,它制備簡便且表面易于進(jìn)行化學(xué)修飾(如修飾疏水性、親水性基團(tuán)或生物識別分子等)而使通道表面改性,為其應(yīng)用提供了廣闊的空間。Chun等利用修飾HS(CH2)10COOH的金納米通道,在電場的作用下對牛血清白蛋白(BSA)和牛血紅蛋白(BHb)進(jìn)行分離,并討論了溶液的離子強(qiáng)度、酸度以及應(yīng)用電位對分離的影響。黃杉生等利用表面修飾Cl-的金納米通道作為納米通道陣列傳感器對免疫球蛋白(IgG)進(jìn)行定量測定,檢測的靈敏度很高,檢出限達(dá)0.34μg/L。這主要是納米通道陣列對響應(yīng)信號有一定的放大作用,用它對生物分子進(jìn)行定量分析具有較高的靈敏度,有利于對生物分子進(jìn)行定量分析測定。目前利用金納米通道對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的報道很多,但用于定量分析的報道較少。因此,本研究建立了在電場作用下利用修飾Cl-的金納米通道對BSA進(jìn)行定量分析的方法,并研究了BSA在通道中遷移時引起電流響應(yīng)變化產(chǎn)生的機(jī)理。研究表明,其電流響應(yīng)變化與BSA濃度在1.50×10-10～1.35×10-9mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,可對BSA進(jìn)行定量分析。2實(shí)驗(yàn)部分2.1無砂酸酯超濾膜CHI660A電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司);兩電極系統(tǒng)(均用金絲作為電極);連通池(自制,孔徑?=2.5mm);HitachiS4500掃描電鏡(日本日立公司);聚碳酸酯超濾膜,孔徑為100nm,孔密度為6×108個/cm2,厚度為6～11μm(美國Millipore公司);氨性硝酸銀溶液0.029mol/L;SnCl2(0.026mol/L)-CF3COOH(0.07mol/L)溶液;鍍金液(7.9×10-3mol/L,pH10.2);H2SO4(0.5mol/L);HNO3(25%);磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH7.4);BSA為1.5×10-5mol/L。0.1mol/LKCl溶液。所用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水(美國Millipore公司)。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1金納米通道膜的掃描電鏡的修飾通道的制備參考文獻(xiàn)方法并做適當(dāng)?shù)男薷?。將聚碳酸脂膜?jīng)Sn2+敏化45min、沉積Ag(10min)后,再浸入鍍金液中,渦旋10min(1800r/min)后,放于4℃冰箱中進(jìn)行金沉積,其它步驟同文獻(xiàn)。圖1為沉積8h的金納米通道膜的掃描電鏡圖,通道直徑約為50nm。將金納米通道膜置于0.1mol/LKCl溶液中自組裝12h后,用水淋洗后再用水浸泡30min以除去未組裝到膜上的Cl-,在空氣中晾干待用。2.2.2電化學(xué)i-t分析在連通池的進(jìn)樣池中加入PBS溶液或含一定量BSA的PBS溶液,在透過池中只加入PBS溶液,將電極分別插入進(jìn)樣池和透過池,采用電化學(xué)i-t法進(jìn)行掃描。其中初始電壓為1.0V,采集數(shù)據(jù)時間為0～100s,采集數(shù)據(jù)時間間隔為0.1s,得到它們的i-t曲線。根據(jù)電流響應(yīng)信號的變化進(jìn)行研究分析。3結(jié)果與討論3.1未修飾的納米通道與bsa在pH7.4PBS溶液中,對通道兩端施加電壓,溶液離子遷移通過納米通道時產(chǎn)生電流響應(yīng)。當(dāng)加入BSA的PBS溶液后,它在這兩種納米通道中的遷移電流均降低,其中|Δi|(修飾)為46.5nA,|Δi′|(未修飾)為34.4nA,|Δi|>|Δi′|。這是由于BSA具有一定的體積(Stokes半徑為3.55nm,此半徑比電解質(zhì)溶液離子半徑0.01～0.1nm大很多)。當(dāng)它在這兩種納米通道中進(jìn)行遷移時都會產(chǎn)生一定的遷移阻礙效應(yīng),使電流響應(yīng)降低;在pH7.4時,BSA帶有負(fù)電荷,它與修飾通道產(chǎn)生一定的靜電排斥作用,影響在通道中的遷移,因而使得電流響應(yīng)進(jìn)一步降低,使得|Δi|>|Δi′|。此外,BSA在未修飾的納米通道中遷移響應(yīng)的穩(wěn)定性比經(jīng)Cl-修飾的納米通道差,主要是由于BSA在未修飾的通道中遷移時有一定的吸附,影響它的遷移穩(wěn)定性。因此,本實(shí)驗(yàn)主要研究BSA在修飾Cl-的通道中的遷移行為。圖2為BSA在修飾Cl-通道中遷移的電流響應(yīng)i-t曲線,以電流響應(yīng)的變化(|Δi|)作為檢測的依據(jù),對BSA在納米通道中的遷移進(jìn)行研究和定量分析。3.2ph對bsa遷移的影響由于在不同的pH時,BSA所帶凈電荷數(shù)目不同,如在pH4.75時,它所帶凈電荷數(shù)為零,此pH是它的等電點(diǎn);而在pH7.4時,它帶有84個正電荷和100個負(fù)電荷,凈帶有16個單位的負(fù)電荷。因此支持電解質(zhì)的pH對BSA在通道中的遷移有很大的影響。圖3為在不同pH時,BSA在修飾通道中遷移的電流響應(yīng)變化曲線。研究表明,BSA遷移電流響應(yīng)|Δi|值隨pH的變化而變化。這是由于當(dāng)pH增高時,BSA所帶凈負(fù)電荷數(shù)也增大。它在通道中遷移時,與通道間的靜電排斥作用也增大,從而使響應(yīng)電流降低變大。因此,|Δi|隨pH增高而增大。本研究中選擇pH為7.4,此時電流響應(yīng)變化值較大,而且接近生理?xiàng)l件,有利于對生物樣品的分析。3.3bsa的電流響應(yīng)考察了加在金納米通道膜兩端的電位對BSA遷移電流響應(yīng)的影響,結(jié)果表明,當(dāng)施加電位達(dá)到某一特定值時,本實(shí)驗(yàn)中空白溶液Eblank為0.275V,BSA的EBSA為0.400V,它們的電流響應(yīng)為零。從Eblank<EBSA可以看出,要使BSA在修飾通道中遷移需要比溶液離子遷移更大的推動力,這與在給定電位下,BSA遷移的電流響應(yīng)比空白溶液的電流響應(yīng)低的結(jié)果一致。電位從0.40～2.0V范圍內(nèi)對BSA測定。結(jié)果表明,BSA溶液遷移產(chǎn)生的電流響應(yīng)隨電位的增加而增大,當(dāng)電位>1.0V時背景電流增大,曲線形狀差,不利于BSA的測定。因此,本研究選用1.0V。3.4各主要內(nèi)在選定的實(shí)驗(yàn)條件下,對不同濃度BSA溶液進(jìn)行了測定。結(jié)果表明,隨著BSA濃度的增大,電流響應(yīng)減小,|Δi|逐漸增大,據(jù)此可對BSA進(jìn)行定量分析。但當(dāng)BSA溶液濃度達(dá)到一定量時,電流響應(yīng)變化較小,趨于一平臺。因?yàn)楫?dāng)溶液中BSA濃度增大時,BSA分子的數(shù)目也增大,它在通道中的阻礙效應(yīng)也變大,因而電流響應(yīng)變化也增大。但當(dāng)BSA的數(shù)目達(dá)到一定值時,BSA在通道中的阻礙效應(yīng)達(dá)到平衡,因此,電流響應(yīng)變化趨于一平臺。結(jié)果表明,BSA的濃度在1.50×10-10～1.35×10-9mol/L范圍內(nèi)與|Δi|呈線性關(guān)系,其線性回歸方程為|Δi|(μA)=0.0069+0.125c(×10-9mol/L),其中在各濃度點(diǎn)測定3次