HPLC-DAD測定5種苯類化合物（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）環(huán)境工程劉鵬123351一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．掌握高效液相色譜分析法中的基本原理（包括分配分離原理、二極管陣列檢測器檢測原理）。基本了解高效液相色譜（1200LC）組成結(jié)構(gòu)，硬件操作及掌握化學(xué)工作站的開機(jī)，關(guān)機(jī)，參數(shù)設(shè)定，數(shù)據(jù)采集及分析的基本操作。了解二極管陣列檢測器的基本原理和特點(diǎn)，基本掌握從三維圖譜中找出化合物的最大吸收波長。掌握高效液相色譜定性、外標(biāo)定量方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理分配色譜原理：主要基于樣品分子在流動相和固定相間的溶解度不同（分配作用）而實(shí)現(xiàn)分離的液相色譜分離模式。C18柱-反相HPLC（reversedphaseHPLC）：由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠，代表性的流動相是甲醇和乙腈。是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機(jī)物質(zhì)的分離。二極管陣列檢測器（diode-arraydetector,DAD）工作原理：以光電二極管陣列（或CCD陣列，硅靶攝像管等）作為檢測元件的UV-VIS檢測器，它可構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長的信號，然后，對二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長的三維譜圖。與普通UV-VIS檢測器不同的是，普通UV-VIS檢測器是先用單色器分光,只讓特定波長的光進(jìn)入流動池。而二極管陣列UV-VIS檢測器是先讓所有波長的光都通過流動池，然后通過一系列分光技術(shù)，使所有波長的光在接受器上被檢測。（Agilent1200DAD全掃描波長范圍為190nm-950nm）Agilent1200LC液相色譜儀的工作過程：輸液泵將流動相以穩(wěn)定的流速（或壓力）輸送至分析體系，在進(jìn)入色譜柱之前通過自動進(jìn)樣器將樣品導(dǎo)入，流動相將樣品帶入色譜柱，在色譜柱中各組分因在固定相中的分配系數(shù)不同而被分離，并依次隨流動相流至檢測器，檢測到的信號送至數(shù)據(jù)系統(tǒng)記錄、處理或保存。外標(biāo)法定量：外標(biāo)法是色譜分析中一種簡便的定量方法。當(dāng)樣品中所有組分都得到良好的分離并都能被檢測而得到色譜峰時(shí)，則可利用外標(biāo)法定量計(jì)算樣品中各組分的濃度。其定量的依據(jù)是被測物質(zhì)的量與它在色譜圖上的峰面積（或峰高）成正比。數(shù)據(jù)處理軟件（工作站）可以給出包括峰高和峰面積在內(nèi)的多種色譜數(shù)據(jù)。一般由被測物所配標(biāo)準(zhǔn)濃度與峰面積做標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出被測物濃度。三、儀器及試劑1、 儀器：Agilent1200HPLC（四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器、C18色譜柱），穩(wěn)壓電源。2、試劑：色譜級乙腈、甲醇；Miniport超純水；含5個(gè)苯類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品；實(shí)際測試水樣四、實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)樣器洗針進(jìn)樣 進(jìn)樣量20.0吐設(shè)置泵流速1.5ml/l 溶劑停留時(shí)間7.0min H2O 20%后運(yùn)行時(shí)間2.0min甲醇80%時(shí)間表時(shí)間%C0.0801.0801.01100.07.00100.03.柱溫箱溫控溫度 35°C4.DAD信號254 4360 100所需燈28016360 100紫外燈光譜儲存全部范圍：190-400nm五、實(shí)驗(yàn)步驟5.1上機(jī)準(zhǔn)備根據(jù)待測物要求配制5個(gè)濃度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，待測水樣1-2個(gè)（樣品需要前處理），查閱文獻(xiàn)，獲得目標(biāo)分析物質(zhì)或相近物質(zhì)的液相色譜分離條件。檢查線路是否連接完好。檢查流動相、洗針液是否充足，不足則根據(jù)要求添加。有機(jī)流動相必須為進(jìn)口HPLC級，水相可使用Millipore純水機(jī)出水或娃哈哈屈臣氏純凈水。所有流動相在使用前均需用0.2pm的濾膜過濾（水和緩沖液用水相濾膜，有機(jī)相用有機(jī)相濾膜），其中水相需每天更換以保持新鮮。標(biāo)樣和樣品在使用前必須用0.2》m的針頭式濾器（進(jìn)口非分裝）過濾。將樣品放置在樣品托盤上，并記錄相應(yīng)的位置。且第一個(gè)和最后一個(gè)樣品為不含營養(yǎng)鹽的流動相，用于清洗進(jìn)樣系統(tǒng)及管路。（其中有下劃線部分為實(shí)驗(yàn)課程中未涉及部分）5.2開機(jī)打開穩(wěn)壓電源（指針指示220V）,打開儀器面板AccelaAS、AccelaPDA、AccelaPump電源開關(guān)。打開電腦，雙擊工作軟件Xcalibur，在status狀態(tài)欄下看到AS、PDA、Pump三項(xiàng)顯示readytodownload；儀器面板燈除Pump部分的RUN燈呈橙色外，其余燈均為綠色，表明儀器及通訊正常,可進(jìn)行下一步操作。purge管路系統(tǒng)，直至無氣泡。方法如下：打開AccelaPump左側(cè)的門，將塑料針筒接到purge閥的輸出管上，逆時(shí)針擰松purge閥；將Accelapump中的purge閥擰到左邊；點(diǎn)擊軟件雙擊Roadmap中InstrumentSetup圖標(biāo)，顯示InstrumentSetup界面，點(diǎn)擊左側(cè)儀器圖標(biāo)中的AccelaPump，點(diǎn)擊下拉主菜單中AccelaPump欄中的directcontrol跳出該界面；在“takepumpundercontrol"欄打勾，輸入flow為600pl/min，選擇相應(yīng)的流動相（設(shè)為100%）,點(diǎn)擊play鍵開始purge，10min左右可按停止鍵；同樣的方法可purge其它流動相通道，直至管路中沒有氣泡。Purge完后將purge閥順時(shí)針擰到右邊，取下針筒中的廢液倒入指定的廢液桶。檢查AccelaAS門上自動進(jìn)樣針筒上部黃色密封圈上端是否有氣泡，如有氣泡則要先行排氣，方法如下：點(diǎn)擊軟件雙擊Roadmap中InstrumentSetup圖標(biāo)，顯示InstrumentSetup界面，點(diǎn)擊左側(cè)儀器圖標(biāo)中的AccelaAs，點(diǎn)擊下拉主菜單中AccelaAs欄中的directcontrol跳出該界面；選擇Flushsyringe，點(diǎn)擊apply（注意此時(shí)要關(guān)上AS的門）；連續(xù)數(shù)次趕盡氣泡。5.穩(wěn)定泵系統(tǒng)。雙擊軟件Roadmap中InstrumentSetup圖標(biāo)，顯示InstrumentSetup界面，點(diǎn)擊左側(cè)儀器圖標(biāo)中的AccelaPump，點(diǎn)擊下拉主菜單中AccelaPump欄中的directcontrol跳出該界面；在“takepumpundercontrol”欄打勾，輸入所需流動相啟動泵系統(tǒng)，運(yùn)行20min后方可進(jìn)行其它操作（如運(yùn)行sequence）。建立method打開UPLC工作站Xcalibur，雙擊Roadmap界面中的InstrumentSetup圖標(biāo)，點(diǎn)擊AccelaAS、AccelaPDA、AccelaPump圖標(biāo)分別設(shè)置參數(shù)。AccelaAS參數(shù)設(shè)置：除Injectionvolume（可設(shè)為l-20“l(fā)）夕卜，其余參數(shù)請不要更改。AccelaPDA參數(shù)設(shè)置：根據(jù)樣品實(shí)際情況對runlengthtime、spectra、channels等進(jìn)行設(shè)置。AccelaPump參數(shù)設(shè)置：選擇GradientProgram界面，編輯流動相梯度（注意正確選擇通道，以免氣泡進(jìn)入系統(tǒng)）參數(shù)設(shè)置完后保存方法（默認(rèn)路徑為：d:\UPLC\method\）。建立sequence點(diǎn)擊sequenceview圖標(biāo)進(jìn)入sequence編輯界面。對于已建分析方法的樣品，可直接在原來的sequence內(nèi)添加樣品信息。新建sequence，樣品類型選擇Unknown，雙擊InstMeth和ProcMethod（如沒有工作曲線時(shí)可先不填此項(xiàng)）輸入方法名及定量分析方法，輸入分析樣品在AccelaAs中的位置以及進(jìn)樣量，以此類推編輯整個(gè)序列，遍及完后保存序列，并點(diǎn)擊按鈕運(yùn)行。樣品分析點(diǎn)擊按鈕realtimeplotplay可以看到實(shí)時(shí)采集的數(shù)據(jù)。開啟儀器半小時(shí)左右，可觀察到儀器信號基線平穩(wěn)。sequence設(shè)置完畢后，點(diǎn)擊runsequence進(jìn)行樣品分析（注意選擇所需分析樣品的序列號）。在做標(biāo)樣時(shí)，標(biāo)樣也先作為未知樣品分析，待所有樣品分析完后再進(jìn)行定量分析。分析結(jié)束進(jìn)樣系統(tǒng)清洗：以不含營養(yǎng)鹽的流動相為樣品（最后一個(gè)樣品）run2-3次，清洗進(jìn)樣系統(tǒng)。管路及柱系統(tǒng)清洗（重要）：用一定比例的有機(jī)相和純水（不含緩沖鹽以及甲酸、乙酸、醋酸銨等其它添加物）流動相洗柱,至無明顯出峰為止。最后用80%以上的有機(jī)溶劑保存柱子。關(guān)閉工作站窗口，退出工作站；關(guān)閉儀器面板AccelaAS、AccelaPDA、AccelaPump電源開關(guān)；關(guān)閉電腦，關(guān)閉穩(wěn)壓電源。取出樣品瓶，清潔桌面，在儀器使用記錄本上登記。數(shù)據(jù)處理定量分析過程（建立工作曲線）參考“Xcalibur定量分析”說明書。未知樣品結(jié)果分析，打開sequence在ProMeth中輸入定量分析方法。選擇需計(jì)算濃度的樣品，點(diǎn)擊BatchReprocessSetup，選擇Quan欄，Peakdetection&Intergration以及Quantitation（注意其余選項(xiàng)不要打勾），點(diǎn)擊OK。點(diǎn)擊Roadmap進(jìn)入QuanBrowser，打開sequence文件名，選擇顯示所有數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊unknows查看樣品結(jié)果。六、數(shù)據(jù)處理1）原始數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)所得色譜圖VWD1A,波長=254nm(D:\SKL\DATA\20121204\DEF_LC2012-12-0414-05-51\004-0401.D)VWD1A,mAU353025201510577D0OmAU353025201510577D0O濃度（ppm）鄰苯二甲酸二甲酯鄰苯二甲酸二乙酯聯(lián)苯鄰-三聯(lián)苯2-乙基，己基-鄰苯二甲酸酯219.00135.83112.85818.94113.964434.87346.58225.61837.71327.656648.61455.39235.36753.90439.224867.40665.73548.67773.33954.681078.42582.24159.04289.48266.8361234min標(biāo)準(zhǔn)樣品數(shù)據(jù)（2）數(shù)據(jù)處理①根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，做出峰面積隨濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

②根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算實(shí)際單標(biāo)中的物質(zhì)濃度物質(zhì)種類鄰苯二甲酸二甲酯鄰苯二甲酸二乙酯聯(lián)苯鄰-三聯(lián)苯2-乙基，己基-鄰苯二甲酸酯峰面積67.40665.73548.67773.33954.680濃度8.3447.5328.1428.1128.140七、思考題1、為什么溶劑和樣品要過濾?溶劑和樣品過濾非常重要，它會對色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對分析結(jié)果的影響。色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。2、流動相使用前為什么要脫氣？流動相使用前必須進(jìn)行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體（如02）,以防止在洗脫過程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD,可能會造成熒光猝滅。3、如何防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞，以及堵塞后的處理？溶劑的質(zhì)量或污染以及藻類的生長會堵塞溶劑過濾器，從而影響泵的運(yùn)行，尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液（PH=4-7）。以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞。A：請嚴(yán)格執(zhí)行溶劑過濾。B：請勿使用多日存放的蒸餾