大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術(shù)介紹大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)應用介紹通過大規(guī)模體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)哺乳類動物細胞是生產(chǎn)生物制品的有效辦法。上世紀60-70年代，就已創(chuàng)立了可用于大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)和中空纖維細胞培養(yǎng)技術(shù)。近十數(shù)年來，由于人類對生長激素、干擾素、單克隆抗體、疫苗及白細胞介素等生物制品的需求猛增，以傳統(tǒng)的生物化學技術(shù)從動物組織獲取生物制品已遠遠不能滿足這一需求。隨著細胞培養(yǎng)的原理與辦法日臻完善，動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)趨于成熟。所謂動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（large-scaleculturetechnology）是指在人工條件下（設定ph、溫度、溶氧等），在細胞培養(yǎng)工廠（CosmoCat.No.1101-400or1101-800）或生物反映器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動物細胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。現(xiàn)在可大規(guī)模培養(yǎng)的動物細胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多個原代細胞及人二倍體細胞、cho（中華倉鼠卵巢）細胞、BHK-21(倉鼠腎細胞)、Vero細胞(非洲綠猴腎傳代細胞，是貼壁依賴的成纖維細胞)等，并已成功生產(chǎn)了涉及狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品。在過去幾十年來，該技術(shù)經(jīng)有了很大發(fā)展，從使用轉(zhuǎn)瓶(rollerbottle)、CellCube等貼壁細胞培養(yǎng)，發(fā)展為一次性細胞培養(yǎng)工廠（MadebyCosmo）或生物反映器（Bioreactor）進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)。第一代細胞培養(yǎng)技術(shù)核心問題是難以產(chǎn)業(yè)化或者說是規(guī)?；a(chǎn)：一是在工藝生產(chǎn)時不能大規(guī)模制備產(chǎn)品；二是非批量生產(chǎn)容易造成產(chǎn)品質(zhì)量的不均一性；三是難以對同批生產(chǎn)進行生產(chǎn)和質(zhì)量控制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，迫切需要大規(guī)模的細胞培養(yǎng)，特別是培養(yǎng)體現(xiàn)特異性蛋白的哺乳動物細胞，方便獲得大量有用的細胞體現(xiàn)產(chǎn)物。采用玻璃瓶靜置或旋轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng)辦法，已不能滿足所需細胞數(shù)量及其分泌產(chǎn)物。因而必須為工業(yè)化生產(chǎn)開創(chuàng)一種新的技術(shù)辦法。自70年代以來，細胞培養(yǎng)用生物反映器有很大的發(fā)展，種類越來越多，規(guī)模越來越大，較常見的細胞培養(yǎng)生物反映器有空氣提高反映器，中空纖維管反映器，無泡攪拌反映器及籃式生物反映器等。八十年代以來，人們逐步開始以生物反映器培養(yǎng)替代鼠腹水的辦法獲得單克隆抗體。動物細胞是一種無細胞壁的真核細胞，生長緩慢，對培養(yǎng)環(huán)境十分敏感。采用傳統(tǒng)的生物化工技術(shù)進行動物細胞大量培養(yǎng)，除了要滿足培養(yǎng)過程必需的營養(yǎng)規(guī)定外，有必要建立合理的控制模型，進行pH和溶氧（DO）的最佳控制。細胞生物反映器可通過微機有序地定量地控制加入動物細胞培養(yǎng)罐內(nèi)的空氣、氧氣、氮氣和二氧化碳四種氣體的流量，使其保持最佳的比例來控制細胞培養(yǎng)液中的pH值和溶氧水平，使系統(tǒng)始終處在最佳狀態(tài)，以滿足動物細胞的生長對pH值和溶解氧的需要。如為提高或達成一定的溶氧水平可變化通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體中氧氣和氮氣的比例來實現(xiàn)控制DO值的目的。采用二氧化碳/碳酸氫鈉（CO2/NaHCO3）緩沖液系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液的pH值是一種較好的辦法?，F(xiàn)在，由于動物細胞培養(yǎng)技術(shù)在規(guī)模和可靠性方面都不停發(fā)展，且從中得到的蛋白質(zhì)也被證明是安全有效的，因此人們對動物細胞培養(yǎng)的態(tài)度已經(jīng)發(fā)生了變化。許多人用和獸用的重要蛋白質(zhì)藥品和疫苗，特別是那些相對較大、較復雜或糖基化（glycosylated）的蛋白質(zhì)來說，動物細胞培養(yǎng)是首選的生產(chǎn)方式。60年代初，英國AVRI研究所在貼壁細胞系BHK21中將口蹄疫病毒培養(yǎng)成功后，從最初的200ml和800ml玻璃容器開始，很快就放大到30L和100L不銹鋼罐的培養(yǎng)規(guī)模。使用的是基于Eagle's配方的培養(yǎng)基，補充5%成年牛血清和蛋白胨。1967年后來，Wellcome（現(xiàn)為Cooper動物保?。┘瘓F分布于歐洲、非洲和南美洲8個國家的生產(chǎn)廠商，應用此項技術(shù)工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)口蹄疫疫苗和獸用狂犬疫苗，已掌握了5000L的細胞罐大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)?，F(xiàn)在已實現(xiàn)商業(yè)化的產(chǎn)品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒疫苗、巨細胞病毒疫苗、α及β干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促紅細胞素、松弛素、生長激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶及200種單克隆抗體等。其中，口蹄疫疫苗是動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)辦法生產(chǎn)的重要產(chǎn)品之一。1983年，英國Wellcome公司就已能夠運用動物細胞進行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫疫苗。美國Genentech公司應用SV40為載體，將乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳動物細胞內(nèi)進行高效體現(xiàn)，已生產(chǎn)出乙型肝炎疫苗。英國Wellcome公司采用8000LNamalwa細胞生產(chǎn)α干擾素。英國Celltech公司用氣升式生物反映器生α、β和γ干擾素；用無血清培養(yǎng)液在10000L氣升式生物反映器中培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體。美國Endotronic公司用中空纖維生物反映器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞生產(chǎn)出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生長激素等。第二節(jié)大規(guī)模培養(yǎng)慣用辦法根據(jù)動物細胞的類型，可采用貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)等三種培養(yǎng)辦法進行大規(guī)模培養(yǎng)。一、動物細胞生長特性及培養(yǎng)溫度1.細胞生長緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素2.細胞大，無細胞壁，機械強度低，環(huán)境適應性差3.需氧少，不耐受強力通風與攪拌4.群體生長效應，貼壁生長（錨地依賴性）5.培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細胞內(nèi)外，成本高6.原代培養(yǎng)細胞普通繁殖50代即退化死亡根據(jù)在體外培養(yǎng)時對生長基質(zhì)依賴性差別，動物細胞可分為兩類：貼壁依賴型細胞：需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才干生長，大多數(shù)動物細胞，涉及非淋巴組織細胞和許多異倍體細胞均屬于這一類。非貼壁依賴型細胞：無需附著于固相表面即可生長，涉及血液、淋巴組織細胞、許多腫瘤細胞及某些轉(zhuǎn)化細胞。培養(yǎng)細胞的最適溫度相稱于多個細胞或組織取材機體的正常溫度。人和哺乳動物細胞培養(yǎng)的最適溫度為35~37℃。偏離這一溫度，細胞正常的代謝和生長將會受到影響，甚至死亡?？偟膩碚f，培養(yǎng)細胞對低溫的耐力比高溫高。溫度不超出39℃時，細胞代謝強度與溫度成正比；細胞培養(yǎng)置于39~40℃環(huán)境中1h，即受到一定損傷，但仍能恢復；當溫度達43℃以上時，許多細胞將死亡。當溫度下降到30~20℃時，細胞代謝減少，因而與培養(yǎng)基之間物質(zhì)交換減少。首先看到的是細胞形態(tài)學的變化以及細胞從基質(zhì)上脫落下來。當培養(yǎng)物恢復到初始的培養(yǎng)溫度時，它們原有的形態(tài)和代謝也隨之恢復到原有水平。二、貼壁培養(yǎng)（attachmentculture）是指細胞貼附在一定的固相表面進行的培養(yǎng)。1.生長特性：貼壁依賴型細胞在培養(yǎng)時要貼附于細胞培養(yǎng)器皿（板、瓶、片、皿）壁上，細胞一經(jīng)貼壁就快速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進入對數(shù)生長久。普通數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細胞單層。2.貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點：容易更換培養(yǎng)液；細胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。容易采用灌注培養(yǎng)，從而達成提高細胞密度的目的；因細胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。當細胞貼壁于生長基質(zhì)時，諸多細胞將更有效的體現(xiàn)一種產(chǎn)品。同一設備可采用不同的培養(yǎng)液/細胞的比例。合用于全部類型細胞。3.貼壁培養(yǎng)的缺點：與懸浮培養(yǎng)法相比擴大培養(yǎng)比較困難，投資大；占地面積大；不能有效監(jiān)測細胞的生長；4.細胞貼壁的表面：規(guī)定TC技術(shù)解決后含有凈陽電荷和高度表面活性。對微載體而言還規(guī)定具一定電荷密度；若為有機物表面，必須含有親水性，并帶陽電荷。5.貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)：重要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維（背面專項介紹）、玻璃珠、微載體系統(tǒng)（背面介紹）等。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)：培養(yǎng)貼壁依賴型細胞最初采用轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)普通用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反映器接種細胞準備的一條途徑。細胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器-轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不停旋轉(zhuǎn)，使細胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，從而提供較好的傳質(zhì)和傳熱條件。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)含有構(gòu)造簡樸，投資少，技術(shù)成熟，重復性好，放大只需簡樸的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等優(yōu)點。但也有其缺點：勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細胞生長的表面積小，細胞生長密度低，培養(yǎng)時監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制等。現(xiàn)在使用的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)涉及二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機兩類。反映器貼壁培養(yǎng)此種培養(yǎng)方式中，細胞貼附于固定的表面生長，不由于攪拌而跟隨培養(yǎng)液一起流動，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細胞和培養(yǎng)液的設備，能夠采用灌流培養(yǎng)獲得高細胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細胞的生長狀況，故多用于制備用量較小、價值高的生物藥品。CelliGen、CelliGenPlusTM和Bioflo3000反映器是慣用的貼壁培養(yǎng)式生物反映器，用于細胞貼壁培養(yǎng)時可用籃式攪拌系統(tǒng)和圓盤狀載體。此載體是直徑6毫米無紡聚酯纖維圓片，具很高表面積與體積比（1200cm2/g），利于獲得高細胞密度?；@式攪拌系統(tǒng)和載體培養(yǎng)是現(xiàn)在貼壁細胞培養(yǎng)使用最多方式，用于雜交瘤細胞、Hela細胞、293細胞、CHO細胞及其它細胞培養(yǎng)。此種方式培養(yǎng)細胞，細胞接種后貼壁快。三、懸浮培養(yǎng)（suspensionculture）：是指細胞在反映器中自由懸浮生長的過程。重要用于非貼壁依賴型細胞培養(yǎng)，如雜交瘤細胞等；是在微生物發(fā)酵的基礎上發(fā)通起來的。無血清懸浮培養(yǎng)是用已知人源或動物來源的蛋白或激素替代動物血清的一種細胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐步成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向。四、固定化培養(yǎng)（immobilizationculture）：是將動物細胞與水不溶性載體結(jié)合起來，再進行培養(yǎng)。上述兩大類細胞都合用，含有細胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強等優(yōu)點，細胞易于產(chǎn)物分開，有助于產(chǎn)物分離純化。制備辦法諸多，涉及吸附法、共價貼附法、離子/共價交聯(lián)法、包埋法、微囊法等。1.吸附法:用固體吸附劑將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的辦法稱為吸附法（adhesion）。操作操簡便、條件溫和、是動物細胞固定化中最早研究使用的辦法。缺點是：載體的負荷能力低，細胞易脫落。微載體培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)是該辦法的代表，稍后專門介紹。2.共價貼附法:運用共價鍵將動物細胞與固相載體結(jié)合的固定化辦法稱為共價貼附法（attachmentbycovalentbonding）。此法可減少細胞的泄漏，但須引入化學試劑，對細胞活性有影響，且因貼附而造成擴散限制小，細胞得不到保護。3.離子/共價交聯(lián)法:雙功效試劑解決細胞懸浮液，會在細胞間形成橋而絮結(jié)產(chǎn)生交交聯(lián)作用，此固定化細胞辦法稱為離子/共價交聯(lián)法（cross-linkingbycovalentbonding）。交聯(lián)試劑會使某些細胞死亡，也會產(chǎn)生擴散限制。4.包埋法:將細胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細胞的辦法稱為包埋法（entrapment）。優(yōu)點是：環(huán)節(jié)簡便、條件溫和、負荷量大、細胞泄漏少，抗機械剪切。缺點是：擴散限制，并非全部細胞都處在最佳基質(zhì)濃度，且大分子基質(zhì)不能滲入到高聚物網(wǎng)絡內(nèi)部。普通合用于非貼壁依賴型細胞的固定化，慣用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。5.微囊法（microencapsulation）:是用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊里，細胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護細胞少受損傷，故細胞生長好、密度高。微囊直徑控制在200-400μm為宜。制備中應注意：溫和、快速、不損傷細胞，盡量在液體和生理條件下操作；所用試劑和膜材料對細胞無毒害；膜的孔徑可控制，必須使營養(yǎng)物和代謝物自由通過；膜應有足夠機械強度抵抗培養(yǎng)中攪拌。五、抗凋亡方略在細胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應用生物反映器動物細胞大規(guī)模生產(chǎn)過程中，細胞凋亡在細胞死亡中占重要部分。近來研究顯示在大規(guī)模培養(yǎng)生物反映器中細胞的死亡中80%是凋亡所造成,而不是以前所認為的壞死。而在大規(guī)模細胞培養(yǎng)中，細胞死亡是維持細胞高活性和高密度的最大障礙。理論上講，避免或延長細胞死亡，能夠極大提高生物反映器生產(chǎn)重組蛋白的產(chǎn)量。細胞凋亡由一系列基因精確地調(diào)控，是多細胞生物發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)所必需的生理現(xiàn)象。已知凋亡的最后執(zhí)行者是Caspase家族，它們均為半胱氨酸蛋白酶，各識別一種4氨基酸序列，并在識別序列C端天冬氨酸殘基處將底物切斷。Caspase含有可被本身識別的序列，能夠切割活化本身而造成信號放大，并作用于下游Caspase組員，從而形成Caspase家族的級聯(lián)放大，最后作用于效應蛋白，引發(fā)細胞凋亡。因此在大規(guī)模培養(yǎng)時干擾細胞在培養(yǎng)中凋亡的發(fā)生，提高細胞特異性抵制碰到壓力而引發(fā)凋亡的能力，有助于提高細胞的培養(yǎng)密度、延長細胞的培養(yǎng)周期，從而提高目的產(chǎn)品的產(chǎn)量2-3倍。1.營養(yǎng)物質(zhì)抗凋亡在常規(guī)生物反映器構(gòu)造中，營養(yǎng)耗竭或缺少培養(yǎng)基中特殊的生長因子則引發(fā)凋亡，例如血清，糖或特殊氨基酸的耗盡。培養(yǎng)基中添加氨基酸或其它核心營養(yǎng)可克制凋亡、延長培養(yǎng)時間從而提高產(chǎn)品的生產(chǎn)。大規(guī)模培養(yǎng)中細胞凋亡重要由于營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引發(fā)，如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡因素，并且凋亡一旦發(fā)生，補加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動物細胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，細胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。2.基因抗凋亡與凋亡有關(guān)的一系列基因產(chǎn)物可對其進行正、負向的調(diào)控，因此可通過導入對應基因來調(diào)節(jié)細胞凋亡的機制。Bcl-2基因是現(xiàn)在最為有效的抗凋亡基因，在多個細胞系中均體現(xiàn)出很強的抗凋亡活性。3.化學辦法抗凋亡凋亡發(fā)生時細胞許多部位發(fā)生生化物質(zhì)的變化，有些變化如變化細胞氧化還原條件產(chǎn)生活性氧在凋亡信號階段發(fā)生，其它的如破壞線粒體膜電位、激活caspase則發(fā)生在凋亡效應階段，這在絕大多數(shù)細胞死亡中是相似的。因此,制止這些生化物質(zhì)的變化可能制止或最少延遲細胞凋亡的發(fā)生，運用化學物質(zhì)可克制信號效應階段的發(fā)生，被認為是抗調(diào)亡方略之一。大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式深層培養(yǎng)可分為：分批式、流加式、半持續(xù)式、持續(xù)式、持續(xù)式和灌注式五種。一、分批式培養(yǎng)（batchculture）是細胞規(guī)模培養(yǎng)發(fā)展進程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎。該方式采用機械攪拌式生物反映器，將細胞擴大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反映器內(nèi)進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中其體積不變，不添加其它成分，待細胞增加和產(chǎn)物形成積累到適宜的時間，一次性收獲細胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基的操作方式。該方式的特點:操作簡樸。培養(yǎng)周期短，染菌和細胞突變的風險小。反映器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過程中與外部環(huán)境沒有物料交換，除了控制溫度、pH值和通氣外，不進行其它任何控制，因此操作簡樸，容易掌握；直觀反映細胞生長代謝的過程。因培養(yǎng)期間細胞生長代謝是在一種相對固定的營養(yǎng)環(huán)境，不添加任何營養(yǎng)成分,因此可直觀的反映細胞生長代謝的過程,是動物細胞工藝基礎條件或"小試"研究慣用的手段；可直接放大。由于培養(yǎng)過程工藝簡樸，對設備和控制的規(guī)定較低，設備的通用性強，反映器參數(shù)的放大原理和過程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，在工業(yè)化生產(chǎn)中分批式培養(yǎng)操作是傳統(tǒng)的、慣用的辦法，其工業(yè)反映器(Genetech)規(guī)?？蛇_1L。分批培養(yǎng)過程中，細胞的生長分為五個階段：延滯期、對數(shù)生長久、減速期、平穩(wěn)期和衰退期，見圖1。分批培養(yǎng)的周期時間多在3-5天，細胞生長動力學體現(xiàn)為細胞先經(jīng)歷對數(shù)生長久（48-72h）細胞密度達成最高值后，由于營養(yǎng)物質(zhì)耗劫或代謝毒副產(chǎn)物的累積細胞生長進入衰退期進而死亡，體現(xiàn)出典型的生長周期。收獲產(chǎn)物普通是在細胞將近死亡前或已經(jīng)死亡后進行。二、流加式培養(yǎng)（feedingculture）1.流加式培養(yǎng)是在批式培養(yǎng)的基礎上，采用機械攪拌式生物反映器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細胞，細胞初始接種的培養(yǎng)基體積普通為終體積的1/2～1/3，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不停消耗和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基，從而使細胞持續(xù)生長至較高的密度，目的產(chǎn)品達成較高的水平，整個培養(yǎng)過程沒有流出或回收，普通在細胞進入衰亡期或衰亡期后進行終止回收整個反映體系，分離細胞和細胞碎片，濃縮、純化目的蛋白。2.流加培養(yǎng)特點：流加培養(yǎng)根據(jù)細胞生長速率、營養(yǎng)物消耗和代謝產(chǎn)物克制狀況，流加濃縮的營養(yǎng)培養(yǎng)基。流加的速率與消耗的速率相似，按底物濃度控制對應的流加過程，確保合理的培養(yǎng)環(huán)境與較低的代謝產(chǎn)物克制水平。培養(yǎng)過程以低稀釋率流加，細胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中停留時間較長，總細胞密度較高，產(chǎn)物濃度較高。流加培養(yǎng)過程須掌握細胞生長動力學，能量代謝動力學，研究細胞環(huán)境變化時的瞬間行為。流加培養(yǎng)細胞培養(yǎng)基的設計和培養(yǎng)條件與環(huán)境優(yōu)化，是整個培養(yǎng)工藝中的重要內(nèi)容。在工業(yè)化生產(chǎn)，懸浮流加培養(yǎng)工藝參數(shù)的放大原理和過程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，可采用工藝參數(shù)的直接放大。流加培養(yǎng)是現(xiàn)在動物細胞培養(yǎng)中占有主流優(yōu)勢的培養(yǎng)工藝，也是近年來動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)研究的熱點。流加培養(yǎng)中的核心技術(shù)是基礎培養(yǎng)基和流加濃縮的營養(yǎng)培養(yǎng)基。普通進行流加的時間多在指數(shù)生長后期，細胞在進入衰退期之前，添加高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)。能夠添加一次，也可添加多次，??中性pH值部分溶解，可采用泥漿的形式進行脈沖式添加；其它的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動泵進行緩慢持續(xù)流加。4.流加式培養(yǎng)分為兩種類型：單一補料分批式培養(yǎng)和重復補料分批式培養(yǎng)。單一補料分批式培養(yǎng)是在培養(yǎng)開始時投入一定量的基礎培養(yǎng)液，培養(yǎng)到一定時期，開始持續(xù)補加濃縮營養(yǎng)物質(zhì)，直到培養(yǎng)液體積達成生物反映器的最大操作容積，停止補加，最后將細胞培養(yǎng)液一次全部放出。該操作方式受到反映器操作容積的限制，培養(yǎng)周期只能控制在較短的時間內(nèi)。重復補料分批式培養(yǎng)是在單一補料分批式操作的基礎上，每個一定時間按一定比例放出一部分培養(yǎng)液，是培養(yǎng)液體積始終不超出反映器的最大操作容積，從而在理論上能夠延長培養(yǎng)周期，直至培養(yǎng)效率下降，才將培養(yǎng)液全部放出。三、半持續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuousculture）1.半持續(xù)式培養(yǎng)又稱為重復分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機械攪拌式生物反映器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細胞增加和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補足到原有體積，使反映器內(nèi)的總體積不變。這種類型的操作是將細胞接種一定體積的培養(yǎng)基，讓其生長至一定的密度，在細胞生長至最大密度之前，用新鮮的培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，每次稀釋反映器培養(yǎng)體積的1/2~3/4，以維持細胞的指數(shù)生長狀態(tài)，隨著稀釋率的增加培養(yǎng)體積逐步增加?；蛘咴诩毎黾雍彤a(chǎn)物形成過程中，每隔一定時間，定時取出部分培養(yǎng)物，或是條件培養(yǎng)基，或是連同細胞、載體一起取出，然后補加細胞或載體，或是新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)進行培養(yǎng)的一種操作模式。剩余的培養(yǎng)物可作為種子，繼續(xù)培養(yǎng)，從而可維持重復培養(yǎng)，而無需反映器的清洗、消毒等一系列復雜的操作。在半持續(xù)式操作中由于細胞適應了生物反映器的培養(yǎng)環(huán)境和相稱高的接種量，通過幾次的稀釋、換液培養(yǎng)過程，細胞密度經(jīng)常會提高。2.半持續(xù)式特點：培養(yǎng)物的體積逐步增加；可進行多次收獲；細胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長時間。該操作方式的優(yōu)點是操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長時期進行生產(chǎn)，重復收獲產(chǎn)品，可使細胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量始終保持在較高的水平。在動物細胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應用。四、持續(xù)式培養(yǎng)（continuousculture）1.持續(xù)式培養(yǎng)是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，采用機械攪拌式生物反映器系統(tǒng)。該模式是將細胞接種與一定體積的培養(yǎng)基后，為了避免衰退期的出現(xiàn)，在細胞達最大密度之前，以一定速度向生物反映器持續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基；同時，含有細胞的培養(yǎng)物以相似的速度持續(xù)從反映器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過程可無限延續(xù)下去。2.持續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點是反映器的培養(yǎng)狀態(tài)能夠達成恒定，細胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長久。在穩(wěn)定狀態(tài)下細胞所處的環(huán)境條件如營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH值可保持恒定，細胞濃度以及細胞比生長速率可維持不變。細胞極少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響，特別是生物反映器的重要營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺，維持在一種較低的水平，從而使他們的運用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。然而在高的稀釋率下，即使死細胞和細胞碎片及時去除，細胞活性高最后細胞密度得到提高；可是產(chǎn)物卻不停在稀釋，因而產(chǎn)物濃度并為提高；特別是細胞和產(chǎn)物不停的稀釋，營養(yǎng)物質(zhì)運用率、細胞增加速率和產(chǎn)物生產(chǎn)速率低下。3.持續(xù)式培養(yǎng)局限性：由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長，容易造成污染；在長周期的持續(xù)培養(yǎng)中，細胞的生長特性以及分泌產(chǎn)物容易變異；對設備、儀器的控制技術(shù)規(guī)定較高。、持續(xù)式培養(yǎng)操作使用的反映器多數(shù)是攪拌式生物反映器，也能夠是管式反映器。4.持續(xù)式培養(yǎng)的特點：細胞維持持續(xù)指數(shù)增加；產(chǎn)物體積不停增加；可控制衰退期與下降期。五、灌流式培養(yǎng)（perfusionculture）1.灌流式培養(yǎng)是把細胞和培養(yǎng)基一起加入反映器后，在細胞增加和產(chǎn)物形成過程中，不停地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時又持續(xù)不停地灌注新的培養(yǎng)基。它與半持續(xù)式操作的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時，絕大部分細胞均保存在反映器內(nèi)，而半持續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時同時也取出了部分細胞。灌流式培養(yǎng)常使用的生物反映器重要有兩種形式。一種是用攪拌式生物反映器懸浮培養(yǎng)細胞，這種反映器必須含有細胞截流裝置，細胞截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過濾或旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，近來開發(fā)的有多個形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)。中空纖維生物反映器是持續(xù)灌流操作慣用的一種。它采用的中空纖維半透膜，透過小分子量的產(chǎn)物和底物，截流細胞和分子量較大的產(chǎn)物，在持續(xù)灌流過程中將絕大部分細胞截留在反映器內(nèi)；近年來中空纖維生物反映器被廣泛應用于產(chǎn)物分泌性動物細胞的生產(chǎn)，重要用于培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體。另外一種形式是固定床或流化床生物反映器，固定床是在反映器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負壓，迫使培養(yǎng)基不停流經(jīng)填料，有助于營養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細胞在載體中高密度生長。流化床生物反映器是通過流體的上升運動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進行反映，適合于固定化細胞的培養(yǎng)。2.灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點：●細胞截流系統(tǒng)可使細胞或酶保存在反映器內(nèi)，維持較高的細胞密度，普通可達107-109/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量；●持續(xù)灌流系統(tǒng)，使細胞穩(wěn)定的處在較好的的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；●反映速率容易控制，培養(yǎng)周期較長，可提高生產(chǎn)率，目的產(chǎn)品回收率高；●產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時回收到低溫下保存，有助于保持產(chǎn)品的活性。持續(xù)灌注培養(yǎng)是近年用于動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)分泌型重組治療性藥品和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。應用持續(xù)灌流工藝的公司有Genzyme,GeneticInstitute,Bayer公司等。這種辦法最大困難是污染機率較高，長久培養(yǎng)中細胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性，規(guī)模放大過程中工程問題。六、細胞工廠培養(yǎng)細胞工廠(cellfactory)是一種設計精巧的細胞培養(yǎng)裝置。它在有限的空間內(nèi)運用了最大程度的培養(yǎng)表面，從而節(jié)省了大量的廠房空間,并可節(jié)省貴重的培養(yǎng)液。更重要的是，它可有效地確保操作的無菌性，從而避免因污染而帶來的原料、勞務和時間損失。它是對傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的革命。丹麥NUNC公司生產(chǎn)的NUNC細胞工廠是現(xiàn)在應用較多的細胞工廠系統(tǒng)?？捎糜谌缫呙?、單克隆抗體或生物制藥等工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，特別適合于貼壁細胞，也可用于懸浮培養(yǎng)，在從實驗室規(guī)模進行放大時不會變化細胞生長的動力學條件，可提供1，2，10和40盤的規(guī)格使放大變得簡樸易行，低污染風險，節(jié)省空間，培養(yǎng)表面經(jīng)測試確保最有助于細胞貼附和生長。同時，與NUNC的細胞工廠操作儀結(jié)合使用，可全方面實現(xiàn)細胞培養(yǎng)的自動化，從而大大地減低勞動強度和密集度。這套系統(tǒng)使用很方便，可產(chǎn)生類似塑料培養(yǎng)瓶的效果。由組織培養(yǎng)級聚笨乙烯制成，使用后可隨意解決。其最大缺點是：經(jīng)胰酶消化后，很難將細胞完全洗出。第四節(jié)動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反映器介紹動物細胞培養(yǎng)技術(shù)能否大規(guī)模工業(yè)化、商業(yè)化，核心在于能否設計出適宜的生物反映器（bioreactor）。由于動物細胞與微生物細胞有很大差別，傳統(tǒng)的微生物反映器顯然不合用于動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)。首先必須滿足在低剪切力及良好的混合狀態(tài)下，能夠提供充足的氧以供細胞生長及細胞進行產(chǎn)物的合成。一、生物反映器分類現(xiàn)在，動物細胞培養(yǎng)用生物反映器重要涉及：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、填充床反映器、多層板反映器、螺旋膜反映器、管式螺旋反映器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反映器、流化床反映器、中空纖維及其它膜式反映器、攪拌反映器、氣升式反映器等。按其培養(yǎng)細胞的方式不同，這些反映可分為下列三類：1.懸浮培養(yǎng)用反映器：如攪拌反映器、中空纖維反映器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反映器、氣升式反映器；2.貼壁培養(yǎng)用反映器：如攪拌反映器（微載體培養(yǎng)）、玻璃珠床反映器、中空纖維反映器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反映器；3.包埋培養(yǎng)用反映器：如流化床反映器、固化床反映器。二、攪拌罐生長反映器這是最典型、最早被采用的一種生物反映器。這類反映器與傳統(tǒng)的微生物生物反映器類似，真對動物細胞培養(yǎng)的特點，采用了不同的攪拌器及通氣方式。通過攪拌器的作用使細胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液中均勻分布，使養(yǎng)分充足被細胞運用，并增大氣液接觸面，有助于氧的傳遞?，F(xiàn)已開發(fā)的有：籠式通氣攪拌器、雙層籠式通氣攪拌器、槳式攪拌器、海般式攪拌器等。三、氣升式生物反映器1979年初次應用氣升式生物反映器成功的進行了動物細胞的懸浮培養(yǎng)。氣升式生物反映器的話優(yōu)點：●罐內(nèi)液體流動溫和均勻，產(chǎn)生剪切力小，對細胞損傷較?。弧窨芍苯訃娚淇諝夤┭?，因而氧傳遞率較高；●液體循環(huán)量大，細胞和養(yǎng)分都能均勻分布于培養(yǎng)液中；●構(gòu)造簡樸，利于密封并減少了造價。慣用的氣升式反映器有三種：內(nèi)循環(huán)式氣升式、外循環(huán)式氣升式、內(nèi)外循環(huán)式氣升式生物反映器。四、鼓泡式生物反映器與氣升式反映器相類似，是運用氣體鼓泡來進行供氧及混合，其設計原理與氣升式生物反映器也相似。五、中空纖維生物反映器用途較廣，既可用于懸浮細胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細胞的培養(yǎng)。其原理是：模擬細胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，運用反映器內(nèi)數(shù)千根中空纖維的縱向布置，提供細胞近似生理條件的體外生長微環(huán)境，使細胞不停生長。中空纖維是一種細微的管狀構(gòu)造，管壁為極薄的半透膜，富含毛細管，培養(yǎng)時纖維管內(nèi)灌流充以氧氣的無血清培養(yǎng)液，管外壁則供細胞黏附生長，營養(yǎng)物質(zhì)通過半透膜從管內(nèi)滲入出來供細胞生長；對于血清等大分子營養(yǎng)物，劃必須從管外灌入，否則會被半透膜阻隔不能被細胞運用；細胞的代謝廢物也可通過半透膜滲入管內(nèi)，避免了過量代謝物對細胞的毒害作用。優(yōu)點是：●占地空間少；●細胞產(chǎn)量高，細胞密度可達109數(shù)量級；●生產(chǎn)成本低，且細胞培養(yǎng)維持時間長，合用于長久分泌的細胞。六、生物反映器的設計和放大設計的總體考慮是：①構(gòu)造嚴密，能耐受蒸汽滅菌，采用對生物催化劑無害和耐蝕材料制作，內(nèi)壁光滑無死角，內(nèi)部附件盡量減少，以維持純種培養(yǎng)需要；②有良好的氣-液接觸和液-固混和性能和熱量交換性能，使質(zhì)量與熱量傳遞有效地進行；③確保產(chǎn)物質(zhì)量和產(chǎn)量前提下，盡量節(jié)省能源消耗；④減少泡沫產(chǎn)生，或附有消沫裝置以提高裝料系數(shù)，并有必要可靠的參數(shù)檢測和控制儀表并能與計算機聯(lián)機。生物反映器的放大一種新的生物技術(shù)產(chǎn)品從實驗室到工業(yè)生產(chǎn)的開發(fā)過程中，會碰到生物反映器的逐級放大問題，每一級約放大10～100倍。生物反映器的放大，表面看來僅是一種體積或尺度放大問題，事實上并不是那么簡樸。反映器放大研究雖已提出了不少辦法，但還沒有一種是普遍都能合用的?，F(xiàn)在還只能是半理論半經(jīng)驗的，即抓住反映過程中的少量核心性參數(shù)或現(xiàn)象進行放大。有關(guān)氧傳遞問題在生物反映器中，氧的傳遞速率要滿足細胞對氧的攝取速率，并使反映器中溶解氧的濃度CL要維持在一定水平上。這就是說，在穩(wěn)態(tài)狀況下，供氧與需氧間存在下列關(guān)系：KLa(C*-CL)=r此處，KLa為氧的傳遞系數(shù)；C*為相稱氣相氧分壓的溶氧濃度，CL為培養(yǎng)液中溶氧濃度，r為攝氧率。影響供氧的因素從上式可知r=KLa(C*-CL)；因此影響供氧的因素總體上講是KLa和C*-CL值。要增大C*-CL，無非是增大C*值或減少CL值。增大C*的方法，有適宜增加反映器中操作壓力和增大氣相中的氧分壓兩個辦法。在實際操作中，反映器保持一定正壓，以避免大氣中的雜菌從軸封、閥門等處侵入，但在增加罐壓的同時，發(fā)酵代謝所產(chǎn)生的CO2也會更多地溶解于培養(yǎng)液而對發(fā)酵不利。至于CL值，普通不允許過分減小，由于細胞在生長中有一種臨界氧濃度，低于此臨界值，細胞的呼吸將受到克制。影響KLa的因素大致可分為三個方面：一是反映器的構(gòu)造，涉及相對幾何尺寸的比例；二是操作條件，如攪拌功率或循環(huán)泵功率的輸入量，通氣量等；三是培養(yǎng)或發(fā)酵液的物理化學性質(zhì)，如流變特性，特別是其粘度或顯示粘度、表面張力、擴散系數(shù)、細胞形態(tài)、泡沫程度等。生物反映器中的傳熱在細胞培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，熱量的釋放是普遍存在的。這是由于在培養(yǎng)或發(fā)酵過程中細胞與周邊環(huán)境的物質(zhì)產(chǎn)生新陳代謝，即發(fā)生異化（分解）作用和同化（合成）作用，而異化作用普通釋放能量，同化作用則是吸取能量。同化作用涉及細胞生長、繁殖、產(chǎn)物形成所需能量來自細胞對培養(yǎng)基中的基質(zhì)及營養(yǎng)成分的異化。從熱力學角度講，異化所產(chǎn)生能量必然應多于同化所需要能量，而多出的能量則轉(zhuǎn)化為熱能釋放到周邊環(huán)境中去。無論是涉及細胞或酶的反映中，釋放出的熱量都應及時移去，以免影響過程的正常進行，為此在生物反映器中普通都附有冷卻裝置。第五節(jié)微載體培養(yǎng)技術(shù)（microcarrierculturetechnique）一、微載體培養(yǎng)應用此技術(shù)于1967年被用于動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)。通過三十余年的發(fā)展，該技術(shù)現(xiàn)在已漸日趨完善和成熟，并廣泛應用于生產(chǎn)疫苗、基因工程產(chǎn)品等。微載體培養(yǎng)是現(xiàn)在公認的最有發(fā)展前途的一種動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，放大容易?，F(xiàn)在微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)多個類型細胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細胞、成肌細胞、Vero細胞、CHO細胞。使用較多的反映器有兩種：貝朗公司的BIOSTAT?B反映器，使用雙槳葉無氣泡通氣攪拌系統(tǒng)；NBS公司的CelliGen、CelliGenPlusTM和Bioflo3000反映器，使用Cell-lift雙篩網(wǎng)攪拌系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)都能實現(xiàn)培養(yǎng)細胞和收獲產(chǎn)物的有效分離。二、微載體是指直徑在60-250μm，能合用于貼壁細胞生長的微珠。普通是由天然葡聚糖或者多個合成的聚合物構(gòu)成。自VanWezel用DEAE-SephadexA50研制的第一種微載體問世以來，國際市場上出售的微載體商品的類型已經(jīng)達十幾個以上，涉及液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。慣用商品化微載體有三種：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline?！裎⑤d體的大小：增大單位體積內(nèi)表面積（S/F）對細胞的生長非常有利。使微載體直徑盡量小，最佳控制在100-200μm之間?！裎⑤d體的密度：普通為1.03-1.05g/cm2，隨著細胞的貼附及生長，密度可逐步增大?！裎⑤d體的表面電荷：據(jù)研究，控制細胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質(zhì)。若電荷密度太低，細胞貼附不充足，但電荷密度過大，反而會產(chǎn)生“毒性”效應。三、微載體培養(yǎng)原理與操作1.原理：其原理是將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。貼壁依賴性細胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷黏附貼壁、生長和擴展成單層三個階段。細胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才干增殖，故細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的核心。黏附重要是靠靜電引力和范德華力。細胞能否在微載體表面黏附，重要取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。2.攪拌轉(zhuǎn)速：由于動物細胞無細胞壁，對剪切力敏感，因而無法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來增加接觸概率。普通的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時攪時停；數(shù)小時后，待細胞附著于微載體表面時，維持設定的低轉(zhuǎn)速，進入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度75r/min。3.細胞與微載體的相融性，是與微載體表面理化性質(zhì)有關(guān)。普通細胞在進入生理PH值時，表面帶負電荷。若微載體帶正電荷，則運用靜電引力可加緊細胞貼壁速度。若微載體帶負電荷，因靜電斥力使細胞難于黏附貼壁，但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價陽離子作為媒介時，則帶負電荷的細胞也能貼附。4.細胞在微載體表面的生長影響細胞在微載體表面生長的因素諸多，重要有三個方面?！裨诩毎矫?，如細胞群體、狀態(tài)和類型?！裨谖⑤d體方面，如微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時細