蛋白A親和層析介質(zhì)（征求意見稿）編制說明《蛋白A親和層析介質(zhì)》國標(biāo)起草工作小組一月《蛋白A親和層析介質(zhì)》國標(biāo)編制說明（征求意見稿）一、任務(wù)來源本國標(biāo)的制訂任務(wù)列入國標(biāo)化管理委員會專項(xiàng)《國家質(zhì)量基礎(chǔ)的共性技術(shù)研究與應(yīng)用》項(xiàng)目《生物產(chǎn)業(yè)共性技術(shù)原則研究》中課題《海洋生物產(chǎn)品質(zhì)量控制與檢測技術(shù)原則研究》，項(xiàng)目編號“YFF004”。本項(xiàng)任務(wù)由中國原則化研究院提出并歸口，定于完畢。本原則起草工作組由中國科學(xué)院過程工程研究所等單位共同構(gòu)成。二、目的和意義單抗藥品對生產(chǎn)制造純化工藝的效能和成本規(guī)定非常高，單抗分離純化成本占其生產(chǎn)總成本的50-70%，其中蛋白A親和層析介質(zhì)是其生產(chǎn)的核心原材料之一，其性質(zhì)和成本將決定單抗產(chǎn)品的最后身產(chǎn)成本、純度和收率?，F(xiàn)在，80%以上的抗體純化使用蛋白A親和層析。蛋白A親和層析介質(zhì)的載量、穩(wěn)定性等是單抗純化選擇介質(zhì)時的首要考慮。蛋白A來源于金黃色葡萄球菌的一種株系，它含有5個能夠和抗體分子Fc段特異性結(jié)合的構(gòu)造域。將蛋白A偶聯(lián)至基質(zhì)上（以瓊脂糖基質(zhì)為主）制成蛋白A親和層析介質(zhì)，能夠與抗體特異性結(jié)合，選擇性極高，一步親和層析可達(dá)成95%以上的純度。蛋白A親和層析因特異性強(qiáng)、操作簡樸、解決量大等優(yōu)勢，已成為抗體藥品研發(fā)和生產(chǎn)階段的核心純化環(huán)節(jié)。蛋白A親和層析介質(zhì)作為單抗藥品生產(chǎn)過程的核心分離材料之一，其性質(zhì)和成本決定單抗產(chǎn)品的最后純度、收率和生產(chǎn)成本。我國現(xiàn)在尚未建立對應(yīng)的國家及行業(yè)原則，國內(nèi)市場上的蛋白A親和層析介質(zhì)產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，缺少產(chǎn)品生產(chǎn)、檢查和質(zhì)量規(guī)范。這在一定程度上限制了我國蛋白A親和層析介質(zhì)的發(fā)展及有關(guān)層析技術(shù)的應(yīng)用，更妨礙了國內(nèi)單抗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展水平。因此建立蛋白A親和層析分離介質(zhì)的國標(biāo)，對于規(guī)范蛋白A親和介質(zhì)行業(yè)，推動層析技術(shù)應(yīng)用，以及增進(jìn)單抗產(chǎn)業(yè)發(fā)展，均含有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義?，F(xiàn)在，蛋白A親和層析介質(zhì)的性能參數(shù)測定辦法多個多樣，以動態(tài)載量測定辦法為例，一種是將介質(zhì)裝柱并連在層析儀上，平衡，上樣抗體，待流出液濃度與上樣濃度相等時上樣結(jié)束，依次經(jīng)淋洗、洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液體積及洗脫液濃度，計算洗脫載量。另一種則是將介質(zhì)裝柱并連接到層析儀上，平衡、上樣抗體，根據(jù)穿透曲線，以5%穿透處介質(zhì)對抗體的吸附量進(jìn)行載量計算。尚有則是在第二種辦法的基礎(chǔ)上按照10%穿透處介質(zhì)對抗體的吸附量進(jìn)行載量計算。這三種辦法測定同一介質(zhì)樣品得到的成果都有明顯差別。由于測定辦法不同產(chǎn)生的類似問題也出現(xiàn)在其它參數(shù)測定上。這些差別對于介質(zhì)的應(yīng)用存在諸多不便。因此，建立蛋白A親和層析介質(zhì)國標(biāo)，能夠規(guī)范蛋白A層析介質(zhì)的生產(chǎn)與檢查過程，增進(jìn)介質(zhì)和有關(guān)層析技術(shù)在單抗生產(chǎn)等領(lǐng)域的應(yīng)用，并對推動我國層析介質(zhì)在世界范疇內(nèi)的應(yīng)用均含有重要意義。三、原則制訂原則（一）原則編制原則蛋白A親和層析介質(zhì)屬于生物體系分離材料，重點(diǎn)圍繞介質(zhì)的重要性能規(guī)定，設(shè)定對應(yīng)技術(shù)內(nèi)容。在確保產(chǎn)品質(zhì)量的基礎(chǔ)上，充足體現(xiàn)產(chǎn)品的特點(diǎn)。（二）原則制訂重要根據(jù)1、原則編寫遵照GB1.1-《原則化工作導(dǎo)則第1部分：原則的構(gòu)造和編寫規(guī)則》的有關(guān)規(guī)定。2、原則編寫內(nèi)容參考我國與化學(xué)品有關(guān)的法規(guī)、原則，涉及GB/T601化學(xué)試劑原則滴定溶液的制備、GB/T603化學(xué)試劑實(shí)驗(yàn)辦法中所用制劑及制品的制備等等。四、原則重要技術(shù)內(nèi)容（一）原則合用范疇的闡明本原則規(guī)定了蛋白A親和層析介質(zhì)的質(zhì)量規(guī)定、檢測辦法、檢查規(guī)則、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸和貯存的原則。本原則合用于骨架為瓊脂糖微球的分離介質(zhì)的生產(chǎn)與檢測。（二）內(nèi)容提綱蛋白A親和層析介質(zhì)的重要理化性質(zhì)涉及外觀、粒徑及分布、耐受壓力強(qiáng)度測試、配基密度、動態(tài)載量、微生物污染等。2.1外觀2.1.1辦法提綱采用光學(xué)顯微鏡觀察蛋白A親和層析介質(zhì)的外觀形貌。光學(xué)顯微鏡使用普及率高，可觀察范疇普通在數(shù)微米到數(shù)百微米之間，樣品解決過程和觀察過程都簡便易行，觀察成果清晰、重復(fù)性好，是慣用的材料外觀表征辦法之一[1]。蛋白A親和層析介質(zhì)的外觀形貌重要涉及球形和透明性，其尺寸大小在光學(xué)顯微鏡的測量范疇內(nèi)[2]。2.1.2試劑和材料實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682-1992中三級規(guī)定。光學(xué)顯微鏡。砂芯漏斗為G3（4.5-9μm）。真空泵極限真空0.10MPa。2.1.3樣品前解決用量筒量取5mL蛋白A親和層析介質(zhì)，置于50mL砂芯漏斗中。用三級水清洗5次，每次2min，抽干5min。將洗凈的蛋白A親和層析介質(zhì)置于燒杯中，介質(zhì)上應(yīng)有2cm的三級水。混勻后得到蛋白A親和層析介質(zhì)與水的混合體系。2.1.4樣品觀察用塑料吸管吸取1mL蛋白A親和層析介質(zhì)與水的混合體系置于載玻片上，調(diào)節(jié)顯微鏡放大倍數(shù)。以視野里80%以上面積均為介質(zhì)為原則，用塑料吸管增減載玻片上的微球，最后用蓋玻片壓上。調(diào)節(jié)光學(xué)顯微鏡焦距，使視野中的影像清晰。拍攝蛋白A親和層析介質(zhì)照片并保存。圖1蛋白A親和層析介質(zhì)光學(xué)顯微鏡照片2.1.5辦法驗(yàn)證為了擬定檢查辦法，原則起草單位已委托三家單位對辦法進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證。2.2粒徑及其分布2.2.1辦法提綱粒徑和粒徑分布是微球最基本的性質(zhì)參數(shù)，對流速和分辨率都有重要影響[1]。蛋白A親和層析介質(zhì)是球形顆粒，其大小用直徑來量度。微球用于生化分離介質(zhì)時，其粒徑普通較小。常見的蛋白A親和層析介質(zhì)粒徑范疇是45-165μm，平均粒徑是90μm[3]。采用激光粒度分析儀測定蛋白A親和層析介質(zhì)的粒徑辦法十分簡便[1]。平均粒徑及其粒徑分布的定義以下：d其中di為單個介質(zhì)的粒徑，dn為所統(tǒng)計的一定數(shù)量介質(zhì)顆粒的平均值，N為所統(tǒng)計的介質(zhì)顆粒的數(shù)目。2.2.2試劑和材料實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682-1992中三級規(guī)定。砂芯漏斗為G3（4.5-9μm）。真空泵極限真空0.1MPa。2.2.3樣品前解決辦法同2.1.3。2.2.4樣品測定設(shè)立測量顆粒類型為通用型，分散劑類型為水，分析模式為單峰模式，添加樣品進(jìn)行測定。通過激光粒度儀的檢測成果涉及平均粒徑值及其分布圖。以45-165μm為例，根據(jù)粒徑分布（如圖1中表格）按公式（1）計算該粒徑范疇內(nèi)微球數(shù)量所占比例。W粒徑式中：W粒徑——45-165μm粒徑范疇內(nèi)微球數(shù)量所占比例，單位是%；W1，W2，……Wx——符合45-165μm范疇的各粒徑范疇比例，例如圖2中52.481μm-60.256μm的球所占比例為2.85%。體積平均粒徑按公式（2）計算：dv圖2蛋白A親和層析介質(zhì)粒徑分布圖2.2.5允許差同一試樣三次測定成果之差，應(yīng)不超出平均值的5%。表1精密度實(shí)驗(yàn)（n=3）實(shí)驗(yàn)序號平均粒徑值（μm）W粒徑187.947100%287.953100%387.968100%x87.956100%s0.00880RSD(%)0.0102.2.6辦法驗(yàn)證為了擬定檢查辦法，原則起草單位已委托三家單位對辦法進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證。2.3耐受壓力強(qiáng)度測試2.3.1辦法提綱層析過程中，易于裝柱、流速較快、有助于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)等，這些都對介質(zhì)構(gòu)造提出一定規(guī)定。介質(zhì)骨架的剛性直接影響其水力學(xué)通透性，良好的機(jī)械強(qiáng)度確保介質(zhì)在流動相的靜壓力作用下不會變形[4]。普通用壓力-流速曲線表達(dá)流速與柱壓之間的關(guān)系[5]。該曲線以柱壓為橫坐標(biāo)，柱流速為縱坐標(biāo)，反映了介質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度。機(jī)械強(qiáng)度較高的介質(zhì)耐壓性能好，在較高壓力下仍能保持較快流速，從而大大節(jié)省了層析操作時間，層析效率得以提高。過軟的基質(zhì)對液體阻力大，影響流速，延長層析操作時間。層析系統(tǒng)操作簡便，自動化程度高，流速和壓力設(shè)定精確，測定重復(fù)性好，是測定介質(zhì)壓力-流速曲線的通用辦法。2.3.2試劑和材料實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682-1992中三級規(guī)定。砂芯漏斗為G3（4.5-9μm）。真空泵極限真空0.10MPa。中低壓層析系統(tǒng)。2.3.3樣品前解決辦法同2.1.3。2.3.4樣品測定裝柱：將蛋白A親和層析介質(zhì)與水的混合漿液倒入層析柱中，堵住柱子出口，靜置，待柱床層穩(wěn)定（Φ1.60cm×10.00cm），柱子上端充滿水。打開柱子入口，持續(xù)向柱中通入三級水（10個柱體積），保持床層穩(wěn)定。測定：將層析柱連入中低壓層析系統(tǒng)。測定時，從零開始設(shè)定一定流速Vx（mL/min），保持該流速5min后，統(tǒng)計此時柱壓Px(MPa)。繼續(xù)增加流速，并測定對應(yīng)流速下的柱壓。直到壓力達(dá)成0.10Mpa為止。2.3.5成果表達(dá)按公式（3）計算線速度。以線速度（V）與壓力（Px）之間的關(guān)系作圖，由圖讀取最大流速（如圖2）。V=式中：V——線速度，單位為厘米每小時cm/h；Vx——流速，單位為毫升每分鐘mL/min；S——層析柱截面積，單位為平方厘米cm2。圖3蛋白A親和層析介質(zhì)壓力-流速曲線2.3.6允許差同一試樣三次測定成果之差，應(yīng)不超出平均值的10%。表2精密度實(shí)驗(yàn)（n=3）實(shí)驗(yàn)序號最大流速值（cm/h）139024203420x410s14.1RSD(%)3.442.3.7辦法驗(yàn)證為了擬定檢查辦法，原則起草單位已委托三家單位對辦法進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證。2.4配基密度2.4.1辦法提綱親和層析能夠從復(fù)雜的多組分混合物中有選擇性地吸附目的蛋白質(zhì)，一次純化就能夠達(dá)成電泳純。正由于親和配基的特異性吸附的能力，也就造成了親和層析介質(zhì)的價格昂貴。制備性能穩(wěn)定的親和層析介質(zhì)，其核心之處就是要合理的控制配基密度，配基指的是連接在介質(zhì)骨架上起吸附作用的的分子，如酶、染料、金屬離子等[6]。對于蛋白A親和層析介質(zhì)，其配基就是蛋白A。合理的配基密度不僅是親和介質(zhì)的載量達(dá)標(biāo)的先決條件，也是控制親和介質(zhì)成本的必要手段。凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種辦法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機(jī)氮都轉(zhuǎn)變成無機(jī)銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來并為過量的硼酸液吸取，再以原則鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定，可由其氮量計算蛋白質(zhì)含量，故此法是典型的蛋白質(zhì)定量辦法。運(yùn)用此法，我們能夠簡樸便捷地對蛋白A親和層析介質(zhì)的配基密度進(jìn)行標(biāo)定，從而能夠更加好的控制蛋白A親和層析介質(zhì)的性能。2.4.2試劑和材料實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682-1992中三級規(guī)定。砂芯漏斗為G3（4.5-9μm）。真空泵極限真空0.10MPa。中低壓層析系統(tǒng)。2.4.3樣品前解決辦法同2.1.3。2.4.4樣品測定2.4.4.1蛋白A原則曲線建立精確稱量10.0mg蛋白A，溶于1mL水中。配制10mg/mL、6mg/mL、3mg/mL、1.25mg/mL蛋白A原則溶液。精確量取1mL蛋白A原則溶液，將溶液無損失地轉(zhuǎn)移到100mL凱氏燒瓶中，加入50mg硒粉和5mL濃硫酸。置于電爐上加熱。先用小火慢慢加熱至液體呈透明淡綠色（約2h），然后改用大火繼續(xù)加熱30min，當(dāng)液體澄清透明后停止加熱并冷卻。凱氏定氮儀進(jìn)行測定：加入10mL40%的氫氧化鈉溶液，蒸氣浴進(jìn)行反映。用25mL含2%硼酸的溶液（加入5-6滴甲基紅-溴甲酚綠批示劑，淺紫色）收集餾出液，冷凝器的出液口浸于硼酸溶液液面下列。硼酸溶液的體積達(dá)成45mL時冷凝器的出液口離開液面，用去離子水沖洗冷凝器的出液口，至最后體積為50mL時停止收集。用0.05M的鹽酸原則溶液滴定上述硼酸溶液至灰色或藍(lán)紫色為終點(diǎn)，并統(tǒng)計消耗鹽酸原則溶液的體積。以消耗鹽酸原則溶液的體積和對應(yīng)蛋白A的質(zhì)量建立線型關(guān)系得到原則曲線。圖4蛋白A原則曲線擬合得到蛋白A原則曲線：y=0.1187x-0.0851，R2=0.9948。2.4.4.2配基密度測定精確稱取1.00g介質(zhì)樣品，移入干燥的100mL凱氏燒瓶中。后續(xù)操作按照2.4.4.1進(jìn)行。同時取1.00g空白介質(zhì)進(jìn)行上述操作，做空白對照。2.4.5允許差同一試樣三次測定成果之差，應(yīng)不超出平均值的5%。表3精密度實(shí)驗(yàn)（n=3）實(shí)驗(yàn)序號配基密度（mg/mL）17.6627.6036.94x7.40s0.3245RSD(%)4.382.4.6辦法驗(yàn)證為了擬定檢查辦法，原則起草單位已委托三家單位對辦法進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證。2.5動態(tài)載量2.5.1辦法提綱親和介質(zhì)的載量是評價介質(zhì)性能的最重要因素之一。指親和層析介質(zhì)最多能夠吸附上的目的蛋白的量。親和介質(zhì)的載量重要由兩類有關(guān)的的參數(shù)決定：1.對的選擇基質(zhì)、間隔分子和配基，使被吸附的蛋白與配基的互相作用最佳化；2.決定吸附載量的多個動力學(xué)因素如流速、平衡時間和吸附方式。測定辦法普通采用前沿分析法。將一定濃度的目的蛋白樣品持續(xù)的加到親和介質(zhì)上，并監(jiān)測其流出狀況。當(dāng)柱床吸附飽和時，流出液和樣品溶液為同一濃度[7]。再通過變化緩沖液的構(gòu)成，pH、離子濃度、或溫度等，將新的緩沖液注入柱中，遍能有效的洗脫吸附的蛋白質(zhì)。普通通過測定洗脫下的蛋白質(zhì)的量，并認(rèn)為其為該介質(zhì)的載量。另一種則是將介質(zhì)裝柱并連接到層析儀上，平衡、上樣抗體，根據(jù)穿透曲線，以5%穿透處介質(zhì)對抗體的吸附量進(jìn)行載量計算。尚有則是在第二種辦法的基礎(chǔ)上按照10%穿透處介質(zhì)對抗體的吸附量進(jìn)行載量計算。本原則采用10%穿透法進(jìn)行載量測定，重要耗時短，樣品損耗低，與真實(shí)載量靠近，且測定重復(fù)性好，是測定蛋白A介質(zhì)動態(tài)載量的最優(yōu)辦法。2.5.2試劑和材料實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682-1992中三級規(guī)定。砂芯漏斗為G3（4.5-9μm）。真空泵極限真空0.10MPa。中低壓層析系統(tǒng)。2.5.3樣品前解決辦法同2.1.3。2.5.4樣品測定將層析柱連在層析系統(tǒng)中，對載量測定過程進(jìn)行監(jiān)控。動態(tài)結(jié)合載量用10%臨界值表達(dá)，檢測280nm處吸取值。測量并統(tǒng)計樣品hIgG的100%UV信號，涉及不結(jié)合到介質(zhì)上的IgG亞類的紫外吸取。用BufferA以2ml/min的流速至紫外基線平衡；以保存時間為5min的流速上樣，待流穿曲線中hIgG的UV信號濃度為10%的樣品濃度（UV信號）時上樣結(jié)束，統(tǒng)計上樣體積。上樣結(jié)束后用BufferA以2ml/min的流速平衡紫外信號至基線；用BufferB以2ml/min的流速進(jìn)行洗脫。計算動態(tài)結(jié)合載量。圖6是蛋白A親和層析介質(zhì)載量測定層析譜圖。圖5蛋白A親和層析介質(zhì)載量測定層析譜圖2.5.5成果表達(dá)以柱出口蛋白濃度C與入口蛋白濃度C0之比值C/C0與流出液體積作圖，即介質(zhì)的穿透曲線。以柱出口蛋白濃度C達(dá)成入口蛋白濃度C0的10%時，介質(zhì)的吸附容量為介質(zhì)的動態(tài)載量，根據(jù)公式(4)計算:Q10%=C0式中:Q10%——介質(zhì)的動態(tài)載量，單位為毫克每毫升mg/ml；C0——蛋白起始濃度，單位為毫克每毫升mg/mL；V1——柱出口蛋白濃度C達(dá)成入口蛋白濃度C0的10%時流出液體積，單位為毫升mL；V0——管路的死體積，單位為毫升mL；Vgel——介質(zhì)體積，單位為毫升mL。2.5.6允許差同一試樣三次測定成果之差，應(yīng)不超出平均值的10%。表4精密度實(shí)驗(yàn)（n=3）實(shí)驗(yàn)序號動態(tài)載量（mghIgG/mL介質(zhì)）141.28240.32341.08x40.89s0.41RSD(%)1.012.5.7辦法驗(yàn)證為了擬定檢查辦法，原則起草單位已委托三家單位對辦法進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證。2.6微生物污染2.6.1辦法提綱微生物對分離介質(zhì)的污染，不僅影響介質(zhì)本身的質(zhì)量，更嚴(yán)重的是它會在層析過程中影響生物制品的質(zhì)量，進(jìn)而對患者的健康和安全造成危害。因此，將分離介質(zhì)的微生物污染狀況作為產(chǎn)品的一種質(zhì)量指標(biāo)，以避免和控制微生物對分離介質(zhì)的污染，這對提高分離介質(zhì)的質(zhì)量和確保其使用安全性都含有十分重要的意義。普通以介質(zhì)在培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)一段時間繁殖形成的菌體數(shù)目進(jìn)行評價。其中，由單個細(xì)菌（或其它微生物）、細(xì)胞或一堆同種細(xì)胞在適宜固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長繁殖到一定程度，形成肉眼可見的子細(xì)胞群落，定義為菌落。在活菌培養(yǎng)計數(shù)時，由單個菌體或聚集成團(tuán)的多個菌體在固體培養(yǎng)基上生長繁殖所形成的集落，成為菌落形成單位（Colony-FormingUnits，簡稱CFU），以其體現(xiàn)活菌的數(shù)量，即微生物污染狀況。2.6.2試劑和材料實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682-1992中三級規(guī)定。胰蛋白胨大豆瓊脂。恒溫箱（±0.5℃）。砂芯漏斗為G3（4.5-9μm）。真空泵極限真空0.1MPa。旋渦混合器。2.6.3樣品前解決（1）辦法同2.1.3。（2）在空培養(yǎng)皿底部標(biāo)記樣品名稱。按照（GBT5475-離子交換樹脂取樣辦法）直接從產(chǎn)品中抽取5mL蛋白A親和層析介質(zhì)樣品，置于50mL砂芯漏斗中抽干5min。取1mL抽干介質(zhì)，加入1mL三級水，采用旋渦混合器混勻樣品。將含有30mL胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基的錐形瓶進(jìn)行高溫滅菌（121°C，20min），待培養(yǎng)基冷卻到40°C時，用微量移液器吸取1mL混勻后的樣品加入到該錐形瓶中，緩緩混合，把混合物倒入培養(yǎng)皿中，蓋好上蓋。2.6.4樣品測定凝固混合物：在室溫下使混合物凝固。孵育：把培養(yǎng)皿置于恒溫箱中孵育。在孵育期間培養(yǎng)皿需要倒置，在35℃中放置5天。2.6.5成果表達(dá)孵育期后檢查培養(yǎng)皿。計數(shù)菌落形成單位數(shù)（CFU），預(yù)計每毫升樣品中微生物的數(shù)量。圖6蛋白A親和層析介質(zhì)菌落生長狀況實(shí)物圖2.6.6允許差同一試樣三次測定成果之差，應(yīng)不超出5。表5精密度實(shí)驗(yàn)（n=3）實(shí)驗(yàn)序號菌落形成單位數(shù)（CFU）1020302.6.7辦法驗(yàn)證為了擬定檢查辦法，原則起草單位已委托三家單位對辦法進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證。2.7化學(xué)穩(wěn)定性2.7.1辦法提綱層析過程中分離介質(zhì)的化學(xué)構(gòu)造直接影響選擇性和分離效果等，因此對介質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性即骨架構(gòu)造有嚴(yán)格的規(guī)定。穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)有助于使用者在層析和貯存過程中選擇更廣泛的實(shí)驗(yàn)條件。對于蛋白A親和層析介質(zhì)來說，骨架構(gòu)造的降解、配基的脫落等這些構(gòu)造方面的不穩(wěn)定性，不僅影響介質(zhì)的使用壽命，還會對目的產(chǎn)物的純度產(chǎn)生致命的影響[9-11]。以常見分離體系的溶液pH為評價范疇，采用恒溫加速實(shí)驗(yàn)方式，對蛋白A親和層析介質(zhì)開展貯存實(shí)驗(yàn)，以骨架降解重要產(chǎn)物即羥甲基糠醛的絕對質(zhì)量及相對質(zhì)量比例為評價指標(biāo)，對介質(zhì)在這些pH范疇內(nèi)溶液中的穩(wěn)定性狀況進(jìn)行測定。其中，羥甲基糠醛的檢測辦法參考國標(biāo)GB/T18932.18-《蜂蜜中羥甲基糠醛含量的測定辦法液相色譜法——紫外檢測法》和中華人民共和國出入境檢查檢疫行業(yè)原則SN/T4675.8-《出口葡萄酒中5-羥甲基糠醛的測定液相色譜法》進(jìn)行。2.7.2試劑和材料實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682-1992中一級規(guī)定。恒溫箱（±0.5℃）。砂芯漏斗為G3（4.5-9μm）。真空泵極限真空0.1MPa。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。高效液相色譜儀（配有紫外檢測器）。分析天平精度0.1mg。容量瓶100mL和1000mL。注射器10mL。過濾膜0.45μm。甲醇系色譜純。羥甲基糠醛純度≥99%。鹽酸、硼酸、氫氧化鈉均為分析純。2.7.3原則溶液配制原則儲藏溶液：精確稱取適量的羥甲基糠醛原則物質(zhì)于100mL容量瓶，用10mL甲醇溶解，定容，配成0.20mg/mL的原則儲藏液。此溶液可在溫度低于4℃冰箱中冷藏保存兩個月。原則工作溶液：分別吸取適量的羥甲基糠醛原則儲藏溶液至100mL容量瓶中，用10%甲醇溶液稀釋至刻度，配成0.01μg/mL、0.03μg/mL、0.05μg/mL、0.08μg/mL、0.10μg/mL，0.20μg/mL，1.0μg/mL，2.0μg/mL，4.0μg/mL，6.0μg/mL，10μg/mL原則工作溶液。當(dāng)天新鮮配制。2.7.4樣品前解決辦法同2.1.3。2.7.5樣品貯存加速實(shí)驗(yàn)取若干份1.00g抽干白球置于帶蓋玻璃試管內(nèi)。將上述pH3、pH13的溶液各10mL分別置于各試管內(nèi)，平行實(shí)驗(yàn)三次。樣品管在40°C條件下培養(yǎng)7天。7天后，上層清液被轉(zhuǎn)移到干凈的試管內(nèi)。2.7.6上機(jī)前樣品解決1）樣品解決辦法的擬定瓊脂糖凝膠的降解辦法重要有化學(xué)降解、物理降解和酶降解，其中酸降解屬于化學(xué)降解。相比于其它降解辦法，酸降解現(xiàn)在仍是應(yīng)用最廣泛的辦法，該辦法相對簡樸、成本低，可使用的酸涉及固態(tài)酸、檸檬酸、鹽酸、硫酸和醋酸等。對于蛋白A親和層析介質(zhì)來說，由于交聯(lián)作用，凝膠骨架較為穩(wěn)定，因此采用濃鹽酸或濃硫酸提高降解效率。2）樣品解決上層清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（60℃，50轉(zhuǎn)/分），定容至2mL，加入等體積12M鹽酸，100℃水解1h。定容至5mL。另取1.00g抽干白球，加入4mL6M鹽酸，100℃水解1h。定容至5mL。用0.45μm的濾膜過濾，濾液用于液相色譜儀紫外檢測器測定。2.7.7色譜測定1）色譜條件的擬定羥甲基糠醛的測定辦法有比色法、紫外分光光度法和液相色譜法。其中，液相色譜法已經(jīng)作為國標(biāo)成為測定羥甲基糠醛的重要辦法。與其它兩種辦法相比，液相色譜法受干擾小，成果更為精確。色譜柱和色譜條件都是按照液相色譜實(shí)驗(yàn)中最常見的操作條件進(jìn)行選擇，即色譜柱選擇DiamonsilC185μm，250mm×4.6mm（i.d.）或相稱者，流動相是10%甲醇水溶液（甲醇：水=10：90）。流速1.0mL/min。檢測波長285nm。柱溫30℃。進(jìn)樣量10μL。2）原則曲線的繪制在上述色譜條件下對原則工作溶液進(jìn)行檢測，以保存時間對樣品進(jìn)行定性，工作曲線外標(biāo)法對樣品進(jìn)行定量。測定原則工作溶液在上述色譜條件下的峰面積，以峰面積對對應(yīng)濃度繪制原則工作曲線，羥甲基糠醛的參考保存時間為9.79-10.40min范疇內(nèi)，保存時間隨樣品濃度變化而變化濃度越低保存時間越小。羥甲基糠醛原則物質(zhì)色譜圖見圖7。aabb圖7羥甲基糠醛原則物質(zhì)色譜圖2）液相色譜測定在上述色譜條件下對未知樣品進(jìn)行檢測，測定樣品的峰面積，用原則工作曲線對樣品進(jìn)行定量。樣品溶液中羥甲基糠醛的響應(yīng)值應(yīng)在儀器的線性范疇內(nèi)。在上述色譜條件下，羥甲基糠醛的參考保存時間約為9.7-10.25min。含有羥甲基糠醛的樣品色譜圖見圖8。圖8含有羥甲基糠醛的樣品色譜圖3）空白實(shí)驗(yàn)除不加樣品試液外，均按上述環(huán)節(jié)進(jìn)行。2.7.8成果表達(dá)上清液中的羥甲基糠醛的含量按下式計算獲得，計算成果應(yīng)扣除空白值。X=C×VV式中：X——不同pH試樣中羥甲基糠醛的含量，單位是毫克每升（mg/L）；c——從工作曲線求得的試樣溶液中羥甲基糠醛的含量，單位是毫克每升（mg/L）；V——試樣最后的定容體積，單位為毫升（mL）；V0——試樣的取樣體積，單位是毫升（mL）.介質(zhì)在不同pH溶液中的脫落率按下式計算獲得。Y=X——不同pH試樣中羥甲基糠醛的含量，單位是毫克每升（mg/L）；X0——抽干白球試樣中羥甲基糠醛的含量，單位是毫克每升（mg/L）；計算成果用平行測定的算數(shù)平均值表達(dá)，保存兩位有效數(shù)字。2.7.9定量限本辦法的定量限為0.01mg/L。2.7.10允許差同一試樣三次測定成果之差，應(yīng)不超出平均值的10%。pH=3條件下：表6精密度實(shí)驗(yàn)（n=3）實(shí)驗(yàn)序號羥甲基糠醛含量（mg/L）介質(zhì)脫落率（%）10.011050.05020.012610.05730.012110.055x0.011920.054s0.000650.0036RSD(%)5.456.68pH=13條件下：表7精密度實(shí)驗(yàn)（n=3）實(shí)驗(yàn)序號羥甲基糠醛含量（mg/L）介質(zhì)脫落率（%）10.009480.04020.008580.03630.009750.041x0.009270.039s0.000610.0026RSD(%)6.616.782.7.11辦法驗(yàn)證為了擬定檢查辦法，原則起草單位已委托三家單位對辦法進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證。五、重要工作過程1、構(gòu)成原則起草小組原則制訂任務(wù)下達(dá)后，原則制訂單位中國科學(xué)院過程工程研究所和中國原則化研究院構(gòu)成了原則起草小組，本原則重要起草人：黃永東、趙嵐、朱凱、吳學(xué)星、馬光輝、蘇志國、馬愛進(jìn)。2、開展有關(guān)調(diào)研狀況為了更加好地制訂《瓊脂糖分離介質(zhì)》國標(biāo)，原則起草小組完畢了國內(nèi)外有關(guān)資料的收集、整頓、分析，現(xiàn)在國內(nèi)沒有瓊脂糖分離介質(zhì)的國標(biāo)，現(xiàn)有針對離子交換樹脂的有關(guān)原則，如：GBT5758-離子交換樹脂粒度、有效粒徑和均一系數(shù)的測定；GBT13659-001×7強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂；GBT13660-201×7強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂；GBT5757-離子交換樹脂含水量測定辦法等，由于離子交換樹脂系硬樹脂，其理化性質(zhì)與瓊脂糖分離介質(zhì)差別很大，因此有關(guān)國標(biāo)和對應(yīng)的測定辦法也不合用。初步制訂了瓊脂糖分離介質(zhì)理化性質(zhì)檢測內(nèi)容和研究辦法。3、原則起草完善過程根據(jù)GB/T1.1—《原則化工作導(dǎo)則第1部分：原則的構(gòu)造和編寫規(guī)則》、GB/T1.2—《原則化工作導(dǎo)則第2部分：原則中規(guī)范性技術(shù)要素內(nèi)容的擬定辦法》等原則編制規(guī)定，對《瓊脂糖分離介質(zhì)》原則開展了研制工作，瓊脂糖分離介質(zhì)原則起草工作小組完畢了《瓊脂糖分離介質(zhì)》國標(biāo)（草案）。具體時間及所做工作涉及以下：7月，項(xiàng)目正式啟動；7月至12月，制訂瓊脂糖分離介質(zhì)理化性質(zhì)初步研究方案；1月，召開原則草案實(shí)施方案論證會，報告草案初步方案，聽取專家建議；1月至4月，制訂瓊脂糖分離介質(zhì)理化性質(zhì)檢測方案，擬定需要測定的若干理化性質(zhì)，準(zhǔn)備有關(guān)實(shí)驗(yàn)材料，研究樣品前解決條件，初步建立各檢測辦法。在這些工作中我們不停總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，對瓊脂糖分離介質(zhì)進(jìn)行了大量的測定工作，優(yōu)化檢測內(nèi)容，改善檢測辦法，并對辦法檢測精密度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)等。在此基礎(chǔ)上，5月征求了專家意見，起草組按照專家意見對原則內(nèi)容進(jìn)行了修改完善，形成了原則征求意見稿。六、辦法驗(yàn)證及成果本原則征求意見稿中檢測辦法的驗(yàn)證工作，已委托北京理化分析測試中心、北京林業(yè)大學(xué)、中科森輝微球技術(shù)（蘇州）有限公司進(jìn)行驗(yàn)證。三家單位的驗(yàn)證成果表明本原則中的檢測辦法可行、成果可靠，各項(xiàng)檢測指標(biāo)和原則偏差都滿足原則草案所規(guī)定的數(shù)值和范疇。七、與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國標(biāo)的關(guān)系本原則符合國家現(xiàn)行法律、法規(guī)、規(guī)章和強(qiáng)制性國標(biāo)的規(guī)定，本原則有助于《中華人民共和國產(chǎn)品質(zhì)量法》等有關(guān)法律、法規(guī)、規(guī)章和強(qiáng)制性國標(biāo)的實(shí)施。本原則的實(shí)施不涉及對現(xiàn)行原則的廢止?fàn)顩r。八、原則屬性的建議本原則屬于基礎(chǔ)管理原則，建議作為推薦性原則同意公布。九、貫徹國標(biāo)的規(guī)定和方法建議在該原則公布后，建議有關(guān)的管理部門及時組織各級質(zhì)量監(jiān)督檢查機(jī)構(gòu)的質(zhì)量檢查人員進(jìn)行交流和培訓(xùn)，使其純熟掌握瓊脂糖分離介質(zhì)理化性質(zhì)的測定辦法，然后推薦到海洋生物產(chǎn)品質(zhì)量控制與檢測中使用。

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