第九章酶催化反應(yīng)

酶是具有高度選擇性的催化劑，而一般情況下的酶反應(yīng)均是在溫和條件下進(jìn)行的（如常溫、常壓和中性溶液），酶的這些特性使酶能在食品、飲料和診斷工業(yè)中廣泛應(yīng)用。一、酶和細(xì)胞的固定化酶能在各種化合物的合成，尤其是在藥物、手性中間體、特殊的聚合物和生化物質(zhì)合成中顯示出了潛在的吸引力。從生物體系的酶到非生物體系的酶催化，從酶的固定化到非水相酶反應(yīng)，酶的潛在能力正獲得越來越多的開發(fā)和利用。二、酶和細(xì)胞的固定化方法固定化酶：通過物理或化學(xué)的方法將溶液酶轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢ǖ目臻g內(nèi)其運動受到完全或局部約束的一種不溶于水，但仍具活性的酶。它能以固相狀態(tài)作用于底物進(jìn)行催化反應(yīng)。固定化細(xì)胞：將完整的細(xì)胞限定在一定空間內(nèi)活動的一種固定化生物催化劑。注意：由于是具有催化活性的蛋白質(zhì)的固定化，所以必須嚴(yán)格操作條件，盡可能避免酶的高級結(jié)構(gòu)受到損害。1、酶和細(xì)胞的固定化方法★常用方法：吸附法、包埋法、交聯(lián)法、化學(xué)共價法、逆膠束包囊法等★常用載體：活性炭、多孔玻璃、纖維素、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠、海藻酸鹽、明膠、合成的高分子化合物等1）吸附法（最古老、最簡便經(jīng)濟(jì)）特點：●蛋白質(zhì)與載體之間的結(jié)合力很弱.●在很多情況下，酶的非特異性吸附常會引起部分或全部失活，且高濃度的鹽溶液或底物溶液又將加速蛋白質(zhì)的脫附。吸附劑的種類：◆各種礦物質(zhì)和其他無機(jī)載體：高嶺土、多孔玻璃、氧化鋁、二氧化硅等蛋白質(zhì)結(jié)合量通常很低◆纖維素粉：糖苷水解酶在纖維素上有較強的吸附◆離子交換劑（目前最常用）：羧甲基纖維素、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖以及合成的離子交換劑等作用原理：靜電吸引缺點：當(dāng)離子強度增加或者介質(zhì)的pH、溫度改變時，這種結(jié)合發(fā)生分解。如果通過化學(xué)方法增加酶蛋白上的電荷則可使這些影響得到改善。第一個用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化酶：固定化氨基?；浮獙被；肝皆贒EAE-纖維素或DEAE-葡聚糖上制得。◆蛋白質(zhì)載體：膠原蛋白是最常用的一般膠原蛋白載體預(yù)先制成膜狀（膠原膜），膠原膜溶脹，然后浸入酶溶液，酶滲入膜內(nèi)并被吸附，制成酶膜。◆生物特異性吸附劑：如，伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖，可有效地固定一些以糖蛋白為結(jié)構(gòu)的酶。伴刀豆球蛋白A具有凝集紅血球細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的作用，主要是由于伴刀豆球蛋白A能夠與細(xì)胞表面上的單糖和低聚糖發(fā)生特異性結(jié)合。2）包埋法（普適性）包埋法：將酶包裹于凝膠格子或聚合物半透膜微膠囊中的方法特點：●

酶分子本身不直接參加反應(yīng)

●條件較溫和●酶活力回收較高●對底物分子和產(chǎn)物分子的大小有限制，當(dāng)?shù)孜锖彤a(chǎn)物的相對分子質(zhì)量小時，擴(kuò)散阻力就小。載體（1）：格子型包埋法載體常用的：海藻酸鹽、K-角叉菜、瓊脂、三醋酸纖維素和聚丙烯酰胺凝膠等★海藻酸鹽：價格便宜、來源豐富，無毒性，目前應(yīng)用較廣特點：△操作簡便、條件溫和△在高濃度的電介質(zhì)（K+、Na+等）溶液中，固定化顆粒會不穩(wěn)定；△Ca2+等多價離子在磷酸緩沖液中會沉淀，固定化顆粒的機(jī)械強度將降低，最后重新溶解。因此用此法包埋的固定化酶或細(xì)胞不能用于磷酸緩沖溶液中。一般操作方法：先將海藻酸鹽溶于水中，使其具有一定粘度；然后加入一定量的細(xì)胞菌體，并且充分?jǐn)嚢?，使之分散均勻；通過注射器或毛細(xì)管將此菌體懸浮液逐滴注入含有Ca2+、Zn2+、Al3+等多價離子的溶液中，由于離子轉(zhuǎn)移的膠凝作用，海藻酸鹽液滴便形成珠狀的固定化細(xì)胞顆粒。待顆粒經(jīng)過一定時間的硬化后洗凈，即可用于催化反應(yīng)。★聚丙烯酰胺凝膠：蛋白質(zhì)的固定量較高，可達(dá)10~100mg/g單體，目前常用的聚合物載體特點：△聚丙烯酰胺凝膠中孔的大小分布很不均勻，因此要防止酶的漏失?！髡{(diào)節(jié)單體和交聯(lián)劑的用量可以改善聚丙烯酰胺凝膠的滲透性。操作方法：在含酶（或細(xì)胞）的水溶液中，加入一定比例的單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N’-甲撐雙丙烯酰胺；然后在催化劑（二甲氨基丙腈）和引發(fā)劑（過硫酸鉀）的作用下低溫（水浴）聚合；產(chǎn)生的聚合物凝膠便是固定化酶，可通過機(jī)械方法分散成一定大小的粒子。載體（2）：微膠囊包埋材料常用的：火棉、尼龍、聚脲等半滲透的界面聚合物膜如，將含有1,6-二氨基己烷的酶水溶液分散到與水互不相溶的含有己二酰二氯的有機(jī)溶劑中去，水相與有機(jī)相界面上的二胺和二酰氯發(fā)生聚合，形成一個包圍在水相酶溶液珠滴外面的聚酰胺薄膜（即尼龍-6,6-薄膜）。3）交聯(lián)法★交聯(lián)法：利用雙功能基團(tuán)試劑或多功能基團(tuán)試劑使酶發(fā)生分子間交聯(lián)因而得到固定的方法?！锍Ｓ玫脑噭何於?、1,6-亞己基二異氰酸酯、雙重氮聯(lián)苯胺和乙烯-馬來酸酐共聚物等?！镫p功能基團(tuán)試劑與酶蛋白的交聯(lián)作用，常引起蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的改變，使酶失活?！锍Ｔ诒唤宦?lián)的酶蛋白溶液中添加一定量的輔助蛋白，避免或減少酶在交聯(lián)過程中因化學(xué)修飾造成的失活。如牛血清蛋白和明膠等蛋白的加入往往能提高固定化酶的穩(wěn)定性。4）化學(xué)共價法共價法：使非水溶性載體與酶以共價鍵的形式結(jié)合。主要方法：?；磻?yīng)、芳化和烷基化反應(yīng)、溴化氰法、重氮化反應(yīng)、硅烷基化法等特點：●結(jié)合牢固、半衰期較長●活性回收較低共價偶聯(lián)反應(yīng)的選擇：■酶蛋白上供共價結(jié)合的功能基團(tuán)必須不影響酶的催化活性■反應(yīng)條件盡可能溫和■最好能在水溶液中進(jìn)行反應(yīng)■偶聯(lián)反應(yīng)對酶蛋白上某一類功能基團(tuán)有很高的專一性，而對其他功能基團(tuán)或水溶液幾乎無副反應(yīng)。2、酶催化反應(yīng)的應(yīng)用實例1）在工業(yè)及醫(yī)藥上的應(yīng)用★食品工業(yè)：淀粉制糖、乳品加工、啤酒加工★輕工業(yè)：絲綢脫膠、原料皮的脫毛★氨酸酸、有機(jī)酸生產(chǎn)：酶法拆分外消旋氨基酸、合成氨基酸、合成有機(jī)酸★醫(yī)藥行業(yè)：蛋白酶、膠原酶、鏈激酶等作為藥劑的應(yīng)用；醫(yī)療診斷、分析2）酶催化研究的新動態(tài)★基因工程菌產(chǎn)生酶的應(yīng)用研究例如：將蛋白酶基因克隆到大腸桿菌中?！锩腹潭ɑ?、修飾后參與酶催化反應(yīng)的研究研究固定化酶方法、活性、穩(wěn)定性、產(chǎn)物分離等★在手性化合物拆分中的研究二、微生物轉(zhuǎn)化微生物轉(zhuǎn)化：是利用微生物細(xì)胞的一種或多種酶，作用于一些化合物的特定部位（基團(tuán)），使它轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相類似但具有更大經(jīng)濟(jì)價值的化合物的生化反應(yīng)。利用的是完整細(xì)胞中的酶的活性。這些細(xì)胞可以是活的細(xì)胞——正在生長的或靜態(tài)的（細(xì)胞分裂很少或根本沒有）細(xì)胞，也能使用干細(xì)胞或孢子。微生物轉(zhuǎn)化與化學(xué)過程相比的優(yōu)點：▲微生物轉(zhuǎn)化在溫和的條件下進(jìn)行，化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成要求的產(chǎn)品，不產(chǎn)生分解，而且節(jié)約能源和投資；▲微生物轉(zhuǎn)化作用于基質(zhì)分子的專一位置，產(chǎn)生立體專一性、光學(xué)專一性產(chǎn)物，不需要化學(xué)拆分。微生物轉(zhuǎn)化的發(fā)展：◎20世紀(jì)40年代，微生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的研究蓬勃興起◎首先在甾體轉(zhuǎn)化方面取得巨大成功，并建立了工業(yè)規(guī)模的甾體激素轉(zhuǎn)化操作◎微生物轉(zhuǎn)化在其他種類生理活性化合物如生物堿、抗生素、大麻油和前列腺素合成上也得以應(yīng)用。1、微生物轉(zhuǎn)化一般過程（1）制備培養(yǎng)系統(tǒng)（催化劑）（2）加入底物（3）加入效應(yīng)物（抑制劑或激活劑）（4）保溫反應(yīng)（5）監(jiān)測反應(yīng)過程（6）終止反應(yīng)（7）產(chǎn)物分離2、培養(yǎng)系統(tǒng)類型（1）分批培養(yǎng)：培養(yǎng)基的準(zhǔn)備、接種、細(xì)胞培養(yǎng)、底物加入、保溫直至反應(yīng)完成。（2）連續(xù)培養(yǎng)：連續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基和等速率移去消耗了的培養(yǎng)基，使細(xì)胞在相對長的周期內(nèi)維持穩(wěn)定狀態(tài)。（3）靜息細(xì)胞（有生命的、不生長的細(xì)胞，保持許多酶的活性）：可自由改變反應(yīng)液中底物和菌體的比例，反應(yīng)時間較短，轉(zhuǎn)化生成物中雜質(zhì)較少，因而分離提純?nèi)菀?。?）干細(xì)胞：凍干或