熟地黃提取液對酪氨酸酶的抑制作用研究儀器和藥品：儀器：分光光度計、微量移液器（1ml）、電子天平、容量瓶（10ml、50ml、250ml）、回流裝置一套、沸石、抽濾裝置、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、水浴恒溫箱、燒杯和量筒若干。藥品：熟地黃粉末（約50g）、體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇（200ml）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、L-酪氨酸、酪氨酸酶、去離子水若干。實驗方案：A、熟地黃有效成分的提?。?、干燥熟地黃粉末10.0g+體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇100mL，室溫浸泡24h。2、燒瓶+沸石+上述浸泡液，回流提取3h，冷卻后抽濾取濾液。殘渣再次加50%乙醇100mL回流提取3h，冷卻抽濾取濾液，合并兩次濾液。（回流溫度約80℃。）3、將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60-65℃濃縮回收溶劑，得膏狀提取物。4、稱取適量膏狀提取物+去離子水配置成1mg/mL溶液備用。B、磷酸緩沖溶液（PBS）的配制：1、稱取磷酸氫二鈉13.3984g，加去離子水溶解，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中定容得a液；另稱取磷酸二氫鈉6.9011g，加去離子水溶解，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中定容得b液。2、分別移取a、b兩溶液各50mL至250mL容量瓶中，加去離子水定容，即得pH=6.8的磷酸緩沖溶液。C、L-酪氨酸溶液和酪氨酸酶溶液的配制：1、稱取L-酪氨酸25.6g，用PBS緩沖液定容于50mL容量瓶中，即得L-酪氨酸溶液。2、稱取酪氨酸酶0.3502g，用PBS緩沖液定容于10mL容量瓶中，即得酪氨酸酶溶液。（冰水浴中操作、保存。）D、酪氨酸酶活力的測定：（分光光度法測A475）用微量移液器分別按表一劑量準(zhǔn)確移取a、b、c、d四組樣液，置于37℃水浴中恒溫10min后，各加入0.40mL酪氨酸酶溶液，混勻，37℃溫育反應(yīng)10min，迅速移入比色皿中，測得在475nm處的吸光度Aa、Ab、Ac、Ad，然后按下面的公式計算熟地提取液對酪氨酸酶的抑制率：抑制率=[1-（Ad-Ac）/（Ab-Aa）]×100%表一反應(yīng)液的組成（單位：ml）待測液abcdL-酪氨酸0.000.800.000.80水*/提取物0.80*0.80*0.800.80PBS緩沖液1.400.601.400.60酪氨酸酶0.400.400.400.40合計2.602.602.602.60其中：a：既無底物也無提取物的待測液；b：有底物但無提取物的待測液；c：無底物但有提取物的待測液；d：既有底物也有提取物的待測液。E、擴(kuò)展研究：（測定不同濃度提取物對酶的抑制作用影響）保持待測液各組分一樣，僅僅是加入不同濃度的提取物，讀取從開始2min后在475nm處的吸