生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗設(shè)計報告班級2010級臨床6班姓名、學(xué)號：劉順偉：1010150622李朝杰1010150619評分一、實驗項目：牛血清白蛋白的提取與鑒定二、實驗?zāi)康恼莆针娪镜幕驹?，加深對蛋白質(zhì)兩性解離性質(zhì)的理解。掌握醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)的基本操作。掌握血清白蛋白的提取與鑒定方法。三、實驗原理帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳。電泳技術(shù)被廣泛用于許多大分子物質(zhì)的分離與鑒定，電泳過程中帶電粒子的移動速度與粒子荷電量、電場強(qiáng)度、粒子重量與半徑及介質(zhì)的黏度有關(guān)。其中粒子荷電量又受周圍介質(zhì)的PH和離子強(qiáng)度的影響；電場強(qiáng)度則取決于電泳時所加的電壓。為了克服溶液對電泳離子的影響一般在電泳體系中加入不流動的固相支持物。根據(jù)支持物的不同，將電泳分為許多種類，如濾紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳等。牛血清白蛋白（即清蛋白）是牛血清中的簡單蛋白，是血液的主要成分，分子量69KD。等電點4.88。應(yīng)用相同濃度硫酸胺鹽析法將血清中白蛋白與其它球蛋白分離，最后用透析法除鹽，即可提取白蛋白。再利用醋酸纖維素薄膜電泳法對牛血清白蛋白進(jìn)行分離，之后染色鑒定。本實驗系以醋酸纖維素薄膜為固體支持物，用于分離血清蛋白質(zhì)，由于清蛋白及幾種球蛋白的特性不同，可被分為清蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白等部分：四、實驗步驟（一）鹽析取離心管一支加入牛血清2ml、加入等量PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水）稀釋血清，搖勻后，逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨溶液2ml，邊加邊搖，充分混勻，然后靜止放置10分鐘，再離心（4000r/min）10min，將上清液侵入試管中。（二）透析取玻璃紙一張，折成袋形，將離心后的上清液倒入袋內(nèi)，用線扎緊上口（注意要留有空隙），用玻璃棒懸在盛有半杯蒸餾水的100ml燒杯內(nèi)，使透析袋下半部侵入水中，對蛋白液進(jìn)行透析，常用玻璃棒攪拌袋外（燒杯中）液體，以縮短透析時間。更換蒸餾水多次，用納氏試劑檢查袋外液體的NH4+，觀察顏色變化，直至袋內(nèi)鹽分透析完畢。將袋內(nèi)液體傾入試管，即得牛血清白蛋白溶液。（三）電泳1．準(zhǔn)備：取一條大小為2.5cm×8cm的醋酸纖維薄膜（可根據(jù)需要選擇薄膜的大?。?，鑒別薄膜的光滑面和非光滑面，并用鉛筆作標(biāo)記，浸入緩沖液中，20分鐘后，用鑷子輕輕取出，將薄膜無光澤的一面向上，平放在干凈濾紙上，薄膜上再放一張干凈濾紙，吸去多余的緩沖液。以醋酸纖維薄膜的無光澤面下端1.5cm處作為點樣線。2．點樣：用點樣器在盛有血清的表面皿中蘸取少量血清，點樣器下端粘上薄層血清，然后將點樣器豎直使其沾有血清的頂端緊貼在薄點樣線上，待血清全部滲入膜內(nèi)后，移開點樣器。3．電泳：將薄膜平貼于已放在電泳槽上、點樣面朝下，光面朝上，點樣端為陰極。調(diào)電壓100—120V或電流0.4---0.6mA/cm，時間為50分鐘左右關(guān)閉電源。（四）染色通電完畢后，用鑷子將薄膜取出，直接浸于染色液氨基黑10B中3～5min后取出，立即浸于漂洗液中，分別用漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各漂洗5min，至背景無色，用濾紙吸干薄膜。（五）鑒定比較樣品與待測液中白蛋白在薄膜上的電泳結(jié)果，看位置是否一致五、實驗儀器和試劑儀器：離心管、離心機(jī)、試管、玻璃紙、燒杯、比色磁盤、滴管、玻璃棒、電泳儀、醋酸纖維素薄膜、分光光度計。試劑：牛血清待測液、牛血清樣品、PBS（磷酸鹽緩沖溶液，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液）、pH7.2飽和磷酸銨溶液、納氏試劑、巴比妥緩沖液、氨基黑10B染色液、漂洗液、0.4N氫氧化鈉溶液。六、預(yù)測結(jié)果位置一致，實驗成功。若在待測液的電泳結(jié)果中出現(xiàn)其他球蛋白的黑帶區(qū)域