項目二：超氧化物歧化酶（SOD）的生產(chǎn)一.SOD的概況1.超氧化物歧化酶（SOD）的概念：超氧化物歧化酶是一種廣泛存在于動物、植物、微生物中的金屬酶，是生物體內(nèi)抗氧化酶系中主要成員之一。2.SOD的分類按其結(jié)合的金屬離子（即金屬輔基的成分）可分為：（1）Fe-SOD（2）Mn-SOD（是SOD酶分子內(nèi)所含金屬離子Mn2+）（3）Cu-Zn-SOD（銅．鋅超氧化物）3.SOD的理化性質(zhì)3.1SOD對氰化物和H2O2的敏感性：長時間用過氧化氫處理可使CuZn-SOD和Fe-SOD失活，而Mn-SOD不受影響3.2SOD的吸收光譜特性：CuZn-SOD具有獨特的紫外吸收光譜。由于色氨酸和酪氨酸的含量較低，它在280nm處并沒有最大吸收峰。CuZn-SOD的可見光最大吸收波長都在680nm左右，這反映了酶分子中Cu2+的光學(xué)特性。3.3SOD穩(wěn)定性及影響因素：（1）PH、熱、蛋白酶的影響：SOD在pH5.3～9.6間催化性能良好，在pH4.5～pH11間能穩(wěn)定存在。pH3.6時，CuZn-SOD中95%的Zn要脫落，在pH12.2時，SOD的構(gòu)象會發(fā)生不可逆的轉(zhuǎn)變而使酶失活。

（2）SOD對熱的穩(wěn)定性與溶液中離子強度有關(guān)。當(dāng)離子強度很低時,即使加熱到95℃,其活性損失也很少其他因素：SOD活性受飲料的色澤、成分、酸堿度、乙醇含量等多種因素的影響，只有在無色、近中性、無乙醇飲料中SOD活性較穩(wěn)定。另外還發(fā)現(xiàn)有機溶劑和Cl對SOD的活性具抑制作用。4.SOD的作用它催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2和O2的反應(yīng)，即催化超氧陰離子自由基O2-·發(fā)生歧化反應(yīng)，從而清除O2-·，2O2-·+2H+→H2O2+O2，在生命體的自我保護系統(tǒng)中起著極為重要的作用，在免疫系統(tǒng)中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增強機體抗輻射損傷能力，防衰老。

SOD的主要功能是：清除體內(nèi)多余的自由基，延緩由于自由基侵害而出現(xiàn)的衰老現(xiàn)象，提高人體抵抗自由基誘發(fā)疾病的能力，能抗疲勞、甚至抗腫瘤。二SOD的運用1.藥物SOD是一種新型的抗炎癥藥，根據(jù)SOD作用機制和毒性試驗，它對治療因O2-·引起的各種疾病都有一定的療效。為此，SOD可作為抗衰老、抗炎癥、自身免疫疾病患者廣泛應(yīng)用的醫(yī)藥品。此外，SOD對治療貝切特氏癥、心肌梗塞等血虛性心臟病、膠原病、新生兒呼吸困難綜合癥、防御放射性傷害等也可望有效。2.添加劑國外不少高級化妝品都添加SOD，國內(nèi)也有數(shù)家工廠或公司在開發(fā)和生產(chǎn)SOD化妝品，如大寶SOD密，康妮SOD、SOD康舒達霜劑等。SOD作為化妝品添加劑主要有3個優(yōu)點：（1）有明顯的防曬效果（2）可防皮膚衰老，阻止紫褐質(zhì)（老年斑）的形成（3）有明顯的抗炎效果，對防治皮膚病有一定效果。國外把SOD作為食品添加劑的例子是加在口香糖和飲料中。我國貴州農(nóng)學(xué)院已開發(fā)出刺梨SOD飲料。SOD及修飾過的SOD還可作為外用藥膏、眼藥及牙膏等的添加劑

。3.生化試劑國外已有數(shù)家公司如Sigma公司等出售SOD試劑，國內(nèi)也有廠家批量生產(chǎn)SOD試劑，如中科院上海生化所東風(fēng)試劑廠、南京建成生物工程研究所等。此外，SOD有可能作為某些疾病的探針，如郭彥等人認為腦瘤組織線粒體Mn-SOD降低是轉(zhuǎn)化細胞的可靠生化指標(biāo)之一，并可作為評估腦瘤分化程度的參考。

隨著人們對SOD更廣泛深入的研究，不同類型SOD、SOD修飾物及人工有機合成SOD模擬酶將在醫(yī)療、保健、食品、農(nóng)業(yè)增產(chǎn)等方面發(fā)揮出更大的作用。

三.SOD的生產(chǎn)儀器、試劑和材料：-研缽，石英砂，燒杯（50mL），玻璃棒，pH計，冷凍離心機，離心管-新鮮蒜瓣-0.05mol/L磷酸緩沖溶液（pH7.8），氯仿-乙醇混合液（氯仿-無水乙醇3：5），丙酮（用前預(yù)冷至-10℃）。提取SOD酶去除雜蛋白SOD酶的沉淀分離離心純化超濾濃縮測定蛋白含量冷凍干燥后得成品生產(chǎn)流程：操作步驟：

整個操作過程在0到5℃條件下進行。（1）SOD酶的提取稱取5g大蒜蒜瓣，加入石英研磨破碎細胞后，加入0.05mol/L的磷酸緩沖液（Ph7.8）15ml，繼續(xù)研磨20min，使SOD酶充分溶解到緩沖液中，然后6000r/min冷凍離心15min，棄沉淀，取上清液。（2）去除雜蛋白上清液中加入0.25倍體積的氯仿-乙醇混合液攪拌15min，6000r/min離心15min，棄去沉淀，得到的上清液即為粗酶液。（3）SOD酶的沉淀分離粗酶液中加入等體積的冷丙酮，攪拌15min，6000/min離心15min，得到SOD酶沉淀。（4）將沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸緩沖液5mL中，然后6000r/min離心15min，放棄沉淀，取上清液，用凝膠sephacylS-200進行純化，然后超濾濃縮。（5）用紫外分光光度計測定濃液的蛋白含量（6）將濃縮冷凍干燥后即得成品。四、SOD酶的檢驗原理：連苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出氧氣，生成帶色的中間產(chǎn)物。在自氧化過程的初始階段，黃色中間產(chǎn)物的積累在滯后30~45s后就與時間成線性關(guān)系。中間產(chǎn)物在420nm處有強烈的光吸收，在有SOD存在時由于它能催化生成氧氣與過氧化氫，從而阻止了中間物的積累，通過計算就可以求出SOD的活力。所需溶液的配制：（1）pH值為8.30的50mol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖溶液：25℃下96.5mL1mol/L的LK2HPO4與3.5mL1mol/L的KH2PO4混合后，用水稀釋至2000mL。（2）0.05mol/L連苯三酚溶液：稱取3.15g連苯三酚用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并定容至500mL。2、酶活性的測定：（1）連苯三酚自氧化速率的測定在10ml試管中加入pH值為8.30的50mol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖溶液4.50ml，在25±0.5℃的恒溫水浴中保溫10min，然后加入在25±0.5℃的恒溫水浴中事先預(yù)熱好的連苯三酚溶液（空白管用10mmol/LHCL代替），迅速搖勻倒入1cm比色皿中，以空白管為參比，在325nm下，每隔30s測1次吸光值，連續(xù)記錄3min，調(diào)節(jié)連苯三酚溶液用量，將其自氧化速率控制在0.070（±0.002）D/min。經(jīng)實驗測得連苯三酚溶液的用量為6μ1。（2）樣品活性測定

在10ml試管中加入pH為8.30的4.5ml50mmol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖溶液和一定體積的樣液，在25±0.5℃的恒溫水浴中保溫10min，然后加入在25±0.5℃的恒溫水浴中事先預(yù)熱好的連苯三酚6μ1，（空白管用10mmol/LHCL代替），迅速搖勻倒入1cm比色皿中，以空白管為參比，在325nm下，每隔30s測1次吸光值，連續(xù)記錄3min，調(diào)節(jié)樣液體積，使樣液中連苯三酚的氧化速度控制在0.035（±0.002）D/min，記錄此時樣液體積。五.SOD使用及生產(chǎn)時的注意事項1.SOD的安全性大量試驗和臨床應(yīng)用表明，無論何種給藥方式，除罕見的超敏反應(yīng)外，SOD對人體無毒性。雖然SOD是Mr在30000以上的蛋白質(zhì)，但卻未發(fā)現(xiàn)具有抗原性，其原因也正在進一步研究中。2.SOD生產(chǎn)時的注意事項（1）在破碎細胞時要注意安全，一定要破碎的徹底（2）PH的控制力度很重要，以及在實驗中的溫度等（3）

要學(xué)會正確使用分光光度計紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)