第6章色譜分離過程

Chromatography6.1概述6.2色譜分離過程的基本原理6.3色譜的分類6.4色譜分離過程基礎理論6.5典型制備色譜工藝及應用12定義——也稱色譜層析、色譜、色層；樣品中各組成依據(jù)其在固定相與流動相之間作用行為的差別進行多次分離的過程。發(fā)展史——1903年一位俄國植物學家首次提出。1931年首次應用于制備；1938年適用范圍擴展至無色物質；……6.1概述31903年俄國植物學家Tswett實驗示意圖固定相——CaCO3顆粒流動相——石油醚

色帶4色譜法的特點優(yōu)點：“三高”、“一快”、“一廣”缺點：高選擇性——可將性質相似的組分分開高效能——反復多次利用組分性質的差異產生很好分離效果高靈敏度——10-11~10-13g，適于痕量分析分析速度快——幾~幾十分鐘完成分離一次可以測多種樣品應用范圍廣——氣體，液體、固體物質化學、生化色譜分離、分析

對未知物分析的定性專屬性差需要與其他分析方法聯(lián)用(GC-MS,LC-MS)56.2色譜分離過程的基本原理1.分離原理色譜法之所以可以分離混合物，關鍵是它有一個高效的色譜柱。物質在柱內的分離過程，是物質在固定相和流動相之間發(fā)生吸附、脫附（或溶解、解析）的過程。被分離物按其溶解和解析的能力（或吸附和脫附的能力）的大小，以一定的比例分配在固定相和流動相之間。溶解（吸附）能力大的組分分配給固定相多一些，分配給流動相少一些。這可用分配系數(shù)K表示。6分配系數(shù)的微小差異→吸附能力的微小差異微小差異積累→較大差異→吸附能力弱的組分先流出；吸附能力強的組分后流出72.固定相（色譜柱填料）硅膠衍生的固定相離子交換樹脂大孔吸附樹脂凝膠手性固定相纖維素衍生物環(huán)糊精相聚（甲基）丙烯酰胺π-酸和π-堿固定相83.色譜柱及柱技術色譜柱裝填方法色譜柱設計高壓勻漿填充干法填充徑向壓縮法軸向壓縮法環(huán)形壓縮技術“餅式”柱面進樣軸向流動96.3色譜的分類①根據(jù)色譜法中兩相的物理狀態(tài)分：②根據(jù)固定相的形狀分：10

④按分配原理分：③按分離的動力學過程分：11基本類型色譜法的分離機制基本概念：固定相（s）；流動相（m）（一）吸附色譜法（二）分配色譜法（三）離子交換色譜法（四）空間排阻色譜法12（一）吸附色譜法要求：固定相→吸附劑（硅膠或Al2O3）

具表面活性吸附中心分離機制：見圖示吸附平衡Xm+nYa→Xa+nYm

13分離機制：各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離吸附→解吸→再吸附→再解吸→無數(shù)次洗脫→分開14（二）分配色譜法要求：固定相→機械吸附在惰性載體上的液體流動相→必須與固定相不為互溶載體→惰性，性質穩(wěn)定，不與固定相和流動相發(fā)生化學反應分離機制見圖示

狹義分配系數(shù)15圖示分離機制利用組分在流動相和固定相間溶解度差別實現(xiàn)分離連續(xù)萃取過程back16（三）離子交換色譜法要求：固定相→離子交換樹脂流動相→水為溶劑的緩沖溶液被分離組分→離子型的有機物或無機物分離機制見圖示陽離子交換樹脂

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

固定離子可交換離子待測離子17圖示分離機制：

依據(jù)被測組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同而實現(xiàn)分離back18（四）空間排阻色譜法要求：固定相→多孔性凝膠流動相→水——凝膠過濾色譜流動相→有機溶劑——凝膠滲透色譜分離機制見圖示19圖示分離機制：利用被測組分分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實現(xiàn)分離back20結論：四種色譜的分離機制各不相同，分別形成吸附平衡、分配平衡、離子交換平衡和滲透平衡K分別為吸附系數(shù)，狹義分配系數(shù)，選擇性系數(shù)和滲透系數(shù)。除了凝膠色譜法中的K僅與待測分子大小尺寸、凝膠孔徑大小有關外，其他三種K值都受組分的性質、流動相的性質、固定相的性質以及柱溫的影響。21親和色譜（Affinitychromatography）載體活化、配基連接、吸附、洗脫22色譜圖及有關術語

色譜圖是以組分的響應信號（或濃度）為縱坐標，時間為橫坐標的色譜流出曲線；它提供定性和定量分析的依據(jù)及色譜操作條件的有關信息。如下圖：23(1)基線—沒有組分進入檢測器時，檢測器系統(tǒng)的噪聲隨時間變化的曲線通常為一條直線。當系統(tǒng)不穩(wěn)定時，基線會隨時間而定向緩慢變化的現(xiàn)象，稱為基線的漂移；當系統(tǒng)不穩(wěn)定時，不同因素引起基線的起伏變化的現(xiàn)象，稱為基線的噪聲。(2)保留值—是色譜法定性的依據(jù)。可以用組分在色譜柱中的滯留時間或使組分流出色譜柱所需要的流動相體積表示。①死時間（tR0）--不與固定相發(fā)生作用的組分（空氣或甲烷）流過色譜柱所需的時間。死時間正比于色譜柱中的空隙體積。24②保留時間（tR）--組分流過色譜柱所需要的時間，一般指從進樣到柱后組分濃度最大值時所需的時間。③調整保留時間（t’R）--扣除死時間后的保留時間 （t’R=tR-tM）。用使組分流出色譜柱所需流動相體積表示時為：a．死體積（Vm） VM=tMF0b．保留體積（VR） VR=tRF0c．調整保留體積（V’R）V’R=t’RF0=VR-VM

25(3)峰高與峰面積

峰高是色譜峰的頂點到基線之間的垂直距離，用h表示；峰面積是色譜流出曲線與基線所圍成的面積，用A表示。(4)區(qū)域寬度

是反映分離好壞的一個重要參數(shù)。一般，區(qū)域寬度越窄越好?？捎萌N方法表示：①標準偏差（σ）：0.607倍峰高處峰寬的一半。②峰底寬度（ω）：色譜峰兩側切線在基線上的截距ω

=4σ③半峰寬度（ω

1/2）：又稱半寬度或區(qū)域寬度，峰高一半處的寬度。26271.根據(jù)色譜峰的數(shù)目，可以判斷試樣中所含有組分的最少個數(shù)。

2.根據(jù)色譜峰的保留值可以進行定性分析。3.根據(jù)色譜峰高或面積可以進行定量測定。4.根據(jù)色譜峰間距及其寬度，可對色譜柱的分離效能進行評價。

5.色譜峰間距——固定相或流動相選擇是否合適的依據(jù)。從色譜流出曲線可以獲得許多重要信息：286.4色譜分離過程基礎理論1.保留值、分離度和柱效率①分配系數(shù)（K）：K因物質不同而不同；K是溫度的函數(shù)；是色譜分離的基礎。K大的物質在柱內停留的時間長，反之則反。由于在柱中的多次平衡分配故K有微小差別的組分，在通過柱子后被擴大，從而被分離。29②分配比（k’）：又稱容量因子。③K與k’之比較：式中，β為相比，為柱中流動相體積與固定相體積之比。它反映了柱型的特點：填充柱β=6—35；毛細管柱β=50-1500。30K和k’與物質及兩相的性質有關；K與k’都是溫度、壓力的函數(shù)；K與兩相的體積無關；k’與兩相的體積有關，即與相比有關；K與k’是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù)；K與k’值越大，保留時間越長；31④分離度：相鄰色譜峰峰頂之間的距離除以此兩色譜峰的平均寬度。32⑤柱效率：332.色譜理論模型色譜分離過程涉及到兩個方面：其一是色譜分離與物質在兩相中的分配系數(shù)有關——這由物質（包括組分、流動相、固定相）的分子結構和性質決定——這也就決定了各組分在柱后的出峰時間，即色譜過程中的熱力學因素；其二是色譜分離與物質在柱內的運動情況有關—這由物質在流動相和固定相間的傳質阻力決定—這也就決定了各組分色譜峰的形狀和區(qū)域寬度，即色譜過程的動力學因素。34色譜理論包括兩方面:熱力學理論：研究分配(分離)過程，塔板理論（platetheory）。動力學理論：研究各種動力學因素對峰展寬的影響，速率理論（ratetheory）。35塔板理論(theplatemodel)

1941年，Martin和Synge闡明了色譜、蒸餾和萃取之間的相似性，將色譜柱設想成由許多液液萃取單元或理論塔板組成；與精餾相似，色譜分離也是一個分配平衡過程。這就是Martin等人提出的塔板理論。36塔板理論基本假設

色譜柱由一系列塔板組成

塔板內，組分在兩相間迅速達到平衡（理想色譜）

組分的分配系數(shù)不隨它的濃度變化而變化（線性分布等溫線）

組分的軸向擴散為零

流動相的流動是跳躍過程3738H=L/N塔板理論方程：若扣除死時間（體積）的影響，得到有效塔板數(shù)（n’）和有效塔板高度(H’)：H’=L/N’39它們比理論塔板數(shù)及高度，能更有效地反映色譜分離好壞與塔板數(shù)和塔板高度之間的對應關系。一般說來，色譜柱的理論塔板數(shù)越大，表示組分在色譜柱中達到分配平衡的次數(shù)越多，越有利于分離，但不能說明組分間分離的好壞，因為分離好壞決定于各組分在流動相和固定相之間分配系數(shù)的差別，而不是分配次數(shù)的多少。40無論是有效還是理論塔板數(shù)不能作為實際分離可能的依據(jù)。另一方面，塔板理論中有很多不合實際的假設，如：假定無縱向擴散、分配系數(shù)與濃度無關；再者，塔板理論不能解釋塔板高度是受哪些因素的影響及流動相不同流速下測得的理論塔板數(shù)不同的事實。因而它有一定的局限性。412．速率理論1956年由荷蘭學者范弟姆特把影響塔板高度的動力學因素與塔板理論結合起來，導出了塔板高度與流動相線速關系的方程。認為色譜峰的總擴張等于各獨立因素對擴張影響之和；色譜柱的總板高等于各獨立因素對板高貢獻之和。即式中A、B、C為常數(shù)，A為渦流擴散項，B為分子擴散項系數(shù)，C為傳質阻力項系數(shù)。42（1）渦流擴散項—在填充色譜柱中，當組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似渦流的流動，故稱渦流擴散。填充柱的多孔性，引起的多徑性與填充物的顆粒直徑dp（cm）的大小和填充不均勻性有關。顆粒越大、填充越不均勻，渦流擴散就越嚴重，使板高增大。43（2）分子擴散項（又稱縱向擴散項）B/u–組分在固定相和流動相中的濃差分子擴散。流動相的線速在分子擴散項中使板高減小，但分子擴散項系數(shù)使板高增大。表明B與組分在流動相的擴散系數(shù)和彎曲因子有關。流動相的粘度和相對分子量越小，組分在其中的擴散系數(shù)越大；溫度越高擴散系數(shù)越大。彎曲因子與填充物有關，填充物的存在使分子自由擴散的能力降低；填充物填充的均勻性對彎曲因子影響不是主要的，只要有填充物存在，影響流動相路徑彎曲的因素和減小分子擴散的因素就存在。44（3）傳質阻力項Cu—組分在固定相和流動相中移動的速率，包括：流動相和固定相傳質阻力—即兩相對組分分子運動能力的影響。若傳質阻力大，就會引起組分分子的超前和滯后，從而引起色譜峰的擴張。對氣相色譜的填充柱而言