專題六蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法與及其進(jìn)展蛋白質(zhì)組學(xué)的概念及其發(fā)展史第一節(jié)1、Proteome&ProteomicsProteome：

1994年，由澳大利亞Macguarie大學(xué)的Wilkins等首先提出“proteomeindicatestheproteinsexpressedbyagenome”“proteome”是由protein一詞的前幾個字母“prote”和genome一詞的后幾個字母“ome”拼接而成一、概念對應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個或幾個蛋白質(zhì)。在空間和時間上動態(tài)變化著的整體。Proteomics定義蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對象，研究細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動態(tài)變化規(guī)律的科學(xué)它在本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上、整體角度研究蛋白質(zhì)特征：細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份表達(dá)水平（量）翻譯后的修飾（成熟與調(diào)控）蛋白與蛋白相互作用（信號通路）等由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識2.功能蛋白質(zhì)組(functionalproteome)1997年，由Cordwell和Humphery-Smith提出的，它指的是在特定時間、特定環(huán)境和實驗條件下基因組活躍表達(dá)的蛋白質(zhì)。從局部入手研究蛋白質(zhì)組的各個功能亞群體。將多個亞群體組合起來，逐步描繪出接近于生命細(xì)胞的“全部蛋白質(zhì)”的蛋白質(zhì)組圖譜。3、Proteome與Genome關(guān)系互補(bǔ)的角度/空間來研究細(xì)胞的分子架構(gòu)相輔相成

Genome劇本

Proteome演員Proteome與Genome區(qū)別穩(wěn)定性：Proteome動態(tài)Genome靜態(tài)特異性Proteome組織和細(xì)胞特異性Genome無組織和細(xì)胞特異性復(fù)雜程度Proteome高（20aa+高度多樣性修飾）Genome低（4nt）修飾化程度Proteome高Genome低孤立行為與相互作用：Proteome相互作用

Genome孤立

二、蛋白組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展1、產(chǎn)生背景

基因組時代→后基因組時代研究重點的轉(zhuǎn)移

基因組研究主要包括兩方面的內(nèi)容:

以全基因組測序為目標(biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(StructuralGenomics)

以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)(FunctionalGenomics),后者又往往被稱為后基因組學(xué)。

人類基因組計劃（HumanGenomeProject,HGP，1990年啟動）2023/10/2614Bioinformatics2000年6月26日克林頓宣布人類基因組草圖繪制完成2023/10/2615Bioinformatics

功能基因組學(xué)利用基因組所提供的信息和產(chǎn)物,應(yīng)用新的實驗手段,通過在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能,力圖從基因組整體水平上對基因的活動規(guī)律進(jìn)行闡述。mRNA水平的基因表達(dá)研究取得進(jìn)展，但mRNA與蛋白質(zhì)間的相關(guān)系數(shù)僅為0.4～0.5

蛋白質(zhì)自身特點難以從DNA和mRNA水平上解答其活動規(guī)律

對蛋白質(zhì)的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、相互關(guān)系和生物學(xué)功能進(jìn)行全面深入的研究已成為生命科學(xué)研究的迫切需要和重要任務(wù)。2、進(jìn)展各國政府支持，國際著名研究和商業(yè)機(jī)構(gòu)加盟：1996年澳大利亞建立了世界上第一個蛋白質(zhì)組研究中心（AustraliaProteomeAnalysisFacility，APAF）

美國國立癌癥研究院（NCI）投資1000萬美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢腫瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。NCI和FDA（美國生物評價與研究中心）共同投資數(shù)百萬美元建立癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。英國建立三個蛋白質(zhì)組研究中心對已完成或即將完成全基因組測序的生物體進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究。

Celera公司投資上億美元獨自啟動了全面鑒定和分類匯總?cè)祟惤M織、細(xì)胞和體液中的蛋白質(zhì)及其異構(gòu)體，構(gòu)建新一代的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫的工作。

1997年召開了第一次國際“蛋白質(zhì)組學(xué)”會議

1998年在美國舊金山召開了第二屆國際蛋白質(zhì)組學(xué)會議

1999年1月在英國倫敦舉行了應(yīng)用蛋白質(zhì)組會議

我國也于1998年啟動了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在中科院上海生物化學(xué)研究所舉辦了兩次全國性的蛋白質(zhì)組學(xué)研討會

2003成立了中國人類蛋白質(zhì)組組織（CHHUPO），并分別于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召開了中國蛋白質(zhì)組學(xué)首屆、第二屆及第三屆學(xué)術(shù)大會2004年10月在中國北京召開了第三屆國際蛋白質(zhì)組學(xué)會議。

科技部已將疾病蛋白質(zhì)組研究列入我國“973”計劃項目和“863”計劃項目；國家自然科學(xué)基金委員會也將“蛋白質(zhì)組研究”列為重點項目。我國在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白質(zhì)組研究方面取得了較大的進(jìn)展。早期蛋白質(zhì)組學(xué)的研究范圍主要是指蛋白質(zhì)的表達(dá)模式隨著學(xué)科的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究范圍也在不斷完善和擴(kuò)充。蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的解析目前仍獨樹一幟3、發(fā)展趨勢蛋白質(zhì)組學(xué)研究趨勢在基礎(chǔ)研究方面蛋白質(zhì)組研究技術(shù)已被應(yīng)用到各種生命科學(xué)領(lǐng)域在應(yīng)用研究方面 蛋白質(zhì)組學(xué)將成為尋找疾病分子標(biāo)記和藥物靶標(biāo)最有效的方法之一在技術(shù)發(fā)展方面研究方法將更強(qiáng)調(diào)各種方法間的整合和互補(bǔ)，以適應(yīng)不同蛋白質(zhì)的不同特征蛋白質(zhì)組學(xué)與其它學(xué)科的交叉互動日易顯著存在的問題

蛋白質(zhì)組學(xué)為一種新生領(lǐng)域，目前還處于初期發(fā)展階段，仍有許多困難有待克服。

第二節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法蛋白質(zhì)組研究更為復(fù)雜和困難：蛋白質(zhì)數(shù)目大大超過基因數(shù)目。蛋白質(zhì)隨時間和空間而變化。蛋白質(zhì)性質(zhì)各異。

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究方式無法滿足需要生命現(xiàn)象的發(fā)生往往是多因素影響的，涉及多個蛋白質(zhì)多個蛋白質(zhì)的參與是交織成網(wǎng)絡(luò)的在執(zhí)行生理功能時蛋白質(zhì)的表現(xiàn)是多樣的

傳統(tǒng)對單個蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的方式已無法滿足后基因組時代的要求

發(fā)展高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研究技術(shù)平臺是現(xiàn)在乃至相當(dāng)一段時間內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要任務(wù)。

當(dāng)前主要任務(wù)

蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展既是技術(shù)所推動的也是受技術(shù)限制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究思路與方法策略條件基本路線技術(shù)一、研究策略兩條互補(bǔ)的實驗流程基于凝膠的工作流程（應(yīng)用最廣泛、最成熟） （Gel-basedworkflow）基于液相色譜的工作流程 （LC-basedworkflow）蛋白質(zhì)組學(xué)的經(jīng)典方法

雙向電泳與生物質(zhì)譜聯(lián)用（two-dimensionalgelelectrophoresis/massspectrometry，2-DE/MS），這兩種方法結(jié)合起來可以對復(fù)雜樣品進(jìn)行預(yù)分離、對低豐度蛋白進(jìn)行富集，還可以完成蛋白酶解后多維液相分離選擇哪種方法，哪個試驗流程來分析，需要研究人員根據(jù)不同的蛋白特性、樣品種類以及研究方向和經(jīng)費決定二、蛋白質(zhì)組學(xué)實驗室所需的條件三、蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳圖像分析轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)多肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索生物信息學(xué)分析和比對新的或已知蛋白蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化獲得蛋白初步信息四、實驗技術(shù)(1)用于蛋白質(zhì)分離技術(shù)方面的如雙向凝膠電泳、雙向“高效”柱層析等。(2)用于蛋白質(zhì)鑒定的技術(shù)如質(zhì)譜技術(shù)、凝膠圖像分析、蛋白質(zhì)和多肽的N端、C端測序及氨基酸組成分析等。(3)用于蛋白質(zhì)相互作用及作用方式研究的噬菌體展示技術(shù)和大規(guī)模雙雜交系統(tǒng)。(4)用于分析大量數(shù)據(jù)的生物工程信息學(xué)等。蛋白質(zhì)組研究技術(shù)常用以下手段:

（一）樣品的制備

通?？刹捎眉?xì)胞或組織中的全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。

也可以進(jìn)行樣品預(yù)分級，即將細(xì)胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成不同部分，分別進(jìn)行研究。樣品預(yù)分級的主要方法蛋白質(zhì)溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白質(zhì)定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質(zhì)細(xì)胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等

樣品預(yù)分級主要作用在于提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測靈敏度。樣品制備一般方法

對細(xì)胞、組織等樣品進(jìn)行破碎、溶解、失活或還原,盡可能斷開蛋白質(zhì)間的連接鍵,提取全部蛋白質(zhì)對溶解度差的蛋白質(zhì)(如膜蛋白)和具有高抗性組織(如皮膚)的蛋白質(zhì),則需要添加破膜劑、兼性離子表面活性劑等,以增加蛋白質(zhì)的溶解度,提高提取率。雙向凝膠電泳常規(guī)樣品制備培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品制備組織樣品制備分泌蛋白質(zhì)樣品的制備體液蛋白質(zhì)樣品的制備激光捕獲顯微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)

可直接在顯微鏡下從組織切片中精確分離特定的細(xì)胞或細(xì)胞群。

根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度、分子大小及形狀、電離性質(zhì)、生物學(xué)功能的差異進(jìn)行分離（二）蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離

蛋白質(zhì)組分離的難點：量的問題：不同的蛋白質(zhì)數(shù)量在細(xì)胞內(nèi)可以有很大的差別。酵母細(xì)胞內(nèi)，有些細(xì)胞周期調(diào)控蛋白不到100個分子，二糖基酶可能有200萬個分子。估計蛋白質(zhì)量的動態(tài)差別可達(dá)到106數(shù)量級。質(zhì)的問題：不同的蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)差別很大

雙向凝膠電泳目前仍然是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要分離方法最有實用價值雙向凝膠電泳（2-DE）雙向凝膠電泳（two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)：利用蛋白質(zhì)的等電點和分子量，結(jié)合凝膠化學(xué)特性，分離各種蛋白質(zhì)的方法。高分辨雙向凝膠電泳1975年首先由O’Farrell等創(chuàng)立。1、概念2、原理

第一向在高壓電場下對蛋白質(zhì)進(jìn)行等電聚焦(IEFisoelectrofocusing),

再在第一向垂直方向上，進(jìn)行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)。

IEF是一種根據(jù)樣品的等電點不同而使它們在pH梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)

第一向IEF電泳

pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI蛋白質(zhì)的兼性離子陽離子陰離子PrPrCOO-NH3+PrCOO-NH2PrCOOHNH3+將等電點不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶從而得知其等電點信息根據(jù)第一向等電聚焦方式和條件的不同，將雙向凝膠電泳分為三種系統(tǒng):1)ISO-DALT系統(tǒng)

(isoelectricfocusingfollowedbyseparationwithrespecttomolecularmassexpressedindaltons)2)NEPHＧＥ（nonequilibriumpHgradientelectrophoresis）非平衡pH梯度電泳

3)IPG-DALT（immobilizedpHgradientelectrophoresis）固相pH梯度等電聚焦1)ISO-DALT系統(tǒng)

第一向應(yīng)用載體兩性電解質(zhì),在膠管內(nèi)建立ｐＨ梯度該系統(tǒng)的缺點是pH梯度不穩(wěn)定(如陰極漂移)、重復(fù)性差、上樣量低，故不利于不同實驗室之間進(jìn)行圖譜的比較和數(shù)據(jù)發(fā)布；目前唯一分辯率達(dá)到10000個蛋白質(zhì)斑點的圖譜采用了這一系統(tǒng)2)NEPHＧＥ（非平衡pH梯度電泳）

應(yīng)用載體兩性電解質(zhì),在膠管內(nèi)建立ｐＨ梯度

蛋白質(zhì)樣品被加在pH7～10或pH3.5～l0的凝膠的酸性部分進(jìn)行分離，電泳時間相對比較短。旨在克服平衡pH梯度電泳時的嚴(yán)重陰極漂移和堿性蛋白的丟失。在等電點區(qū)域的遷移須在平衡狀態(tài)之前完成。如果聚焦達(dá)到平衡狀態(tài),堿性蛋白會離開凝膠基質(zhì)而丟失。但很難控制，因此重復(fù)性比較差

發(fā)展于80年代早期.第一相采用IPG膠，其梯度的形成依賴于一些具有不同pK的化合物——固定化電解質(zhì).

該化合物是丙烯酰胺的衍生物，一端的雙鍵可以在聚合中共價結(jié)合到聚丙烯酰胺介質(zhì)中，其另一端的緩沖基團(tuán)R為弱酸或弱堿，可在聚合物中形成弱酸或弱堿的緩沖體系，利用緩沖體系滴定終點附近一段pH范圍就可形成近似線性的pH梯度

3)IPG-DALT（固相pH梯度等電聚焦）固相pH梯度與載體兩性電解質(zhì)pH梯度的不同：

前者在凝膠聚合時候便形成pH梯度，不隨環(huán)境電場條件的改變而改變，后者是在電場中遷移到自己的等電點后才形成pH梯度。

固相pH梯度等電聚焦產(chǎn)生固定的ｐＨ梯度,基本克服了ISO-IEF的缺點。從而達(dá)到高度的重復(fù)性。這是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中用得最多的雙向電泳體系

IPG-IEF電泳儀PAGE凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。SDS處理蛋白后，從而消除了蛋白間的電荷及形狀差異，電泳速度僅與分子量有關(guān)

從而得知其分子量信息第二向垂直SDS電泳

SDS電泳儀EttanDalttwelve電泳系統(tǒng)2-DE原理示意圖3、2-DE分析的基本步驟蛋白質(zhì)溶解變性還原去除蛋白質(zhì)雜利用不同pK固定化電解質(zhì)可配置不同pH范圍的凝膠或利用商業(yè)化軟件設(shè)計

第一相電泳：IPG－IFE平衡第二相電泳：SDS－PAGE考馬斯亮藍(lán)染色、銀染色、銅染色樣品制備IPG膠制備雙相電泳染色凝膠的圖像處理分析斑點檢測原則：使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白

雙向凝膠電泳樣品制備

1）考馬斯亮蘭染色法；

2）銀染法；

3）負(fù)染法；

4）熒光染色法；

5）放射性同位素標(biāo)記法等染色：

2-DE

凝膠蛋白質(zhì)斑點的檢測

通過2-DE得到的蛋白質(zhì)分離圖譜，需要經(jīng)過攝像或掃描轉(zhuǎn)換為以像素為基礎(chǔ)的、具有不同灰度強(qiáng)弱和一定邊界方向的斑點電腦信號。

圖像掃描和分析——ImageScannerII凝膠的圖像處理分析

典型流程凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點檢測和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋：2-DE數(shù)據(jù)庫的建立：2-DE

凝膠蛋白質(zhì)斑點后續(xù)分析取點全自動斑點切取系統(tǒng)（EttanSpotPicker）

人工或自動化儀器酶切膠內(nèi)酶切電洗脫后在溶液中酶切電轉(zhuǎn)移到膜上后在膜上酶切在印跡過程中酶切4、2-DE技術(shù)的特點可分離10～100kD分子量的蛋白質(zhì)高靈敏度和高分辨率便于計算機(jī)進(jìn)行圖像分析處理與質(zhì)譜分析匹配5、2-DE技術(shù)的缺點

極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)以及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效分離。

膠內(nèi)酶解過程費時、費力，難于與質(zhì)譜聯(lián)用實現(xiàn)自動化。非凝膠技術(shù)

液相色譜法liquidchromatography，LC毛細(xì)管電泳capillaryelectrophoresis，CE液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）

蛋白質(zhì)混合物直接通過液相色譜分離以代替2-DE的分離，然后進(jìn)入MS系統(tǒng)獲得肽段分子量，再通過串聯(lián)MS技術(shù)，得到部分序列信息，最后通過計算機(jī)聯(lián)網(wǎng)查詢、鑒定蛋白質(zhì)。

質(zhì)譜（MS）法

1、基本原理：樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異來分離并確定樣品的分子量。

質(zhì)譜是指記錄裂片的相對強(qiáng)度按其質(zhì)荷比的分布曲線。（三）蛋白質(zhì)組研究中的樣品鑒定2、質(zhì)譜儀一臺質(zhì)譜儀一般由進(jìn)樣裝置、離子化源、質(zhì)量分析器、離子檢測器和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)組成。早期質(zhì)譜技術(shù)采用電子轟擊電離,能量太強(qiáng)，而生物大分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且熱不穩(wěn)定，電子轟擊不適于生物大分子分析，僅應(yīng)用與小分子研究領(lǐng)域。20世紀(jì)80年代，電噴霧離子化和基質(zhì)輔助激光解析離子化的出現(xiàn)和應(yīng)用，才使質(zhì)譜技術(shù)真正進(jìn)入到生物大分子分析領(lǐng)域?；|(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）電噴霧質(zhì)譜（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI-MS）用于蛋白質(zhì)分析的主要質(zhì)譜類型“軟電離”的特點沒有直接的外界能量作用于分子,分子電離時保留整個分子的完整性，不會形成碎片離子。靈敏度高、快速、能同時提供樣品的精確分子量和結(jié)構(gòu)信息、既可定性又可定量、并能有效地與各種色譜聯(lián)用來分析復(fù)雜體系。

電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）基質(zhì)輔助激光解析離子化（MALDI）：

是將樣品均勻包埋在固體基質(zhì)中，基質(zhì)吸收激光提供的能量而蒸發(fā)，攜帶部分樣品分子進(jìn)入氣相，并將一部分能量傳遞給樣品分子使其離子化。特點：離子電荷通常為1或2個，而不像ESI中為多電荷，對分子質(zhì)量較大的樣品而言，不會形成復(fù)雜的多電荷圖，因而對圖譜的解析比較清楚。由于MALDI的進(jìn)樣是固相方式，不像ESI的液相進(jìn)樣容易受溶液性質(zhì)的影響，因此對雜質(zhì)的忍耐性較好

3、質(zhì)譜法鑒定和注釋蛋白質(zhì)通過肽質(zhì)譜指紋圖和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配

通過測出樣品中部分肽段一級質(zhì)譜信息或氨基酸序列標(biāo)簽和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配

肽質(zhì)譜指紋圖譜

（peptidemassfingerprinting，PMF）：

每一個蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解成為長短不一的肽段后，同一時間獲得所有肽段分子質(zhì)量而形成一個肽段分子質(zhì)量圖譜，這一圖譜對蛋白質(zhì)應(yīng)是專一而特異的，因此稱為肽質(zhì)量指紋圖譜。比傳統(tǒng)方法速度快、通量高，是最早用于大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜方法，也是目前最簡便的蛋白質(zhì)鑒定方法之一。部分肽段一級質(zhì)譜信息、氨基酸序列標(biāo)簽法鑒定蛋白質(zhì)

在MS/MS或PSD（肽序列標(biāo)簽）-MS對肽段的序列分析中，通常獲得的是部分序列，特別是肽段中段的序列，根據(jù)肽段的部分序列和序列兩端的肽質(zhì)量，可以對肽段進(jìn)行鑒定。實驗方法完整蛋白質(zhì)（如凝膠分離或色譜純化蛋白質(zhì)）肽混合物質(zhì)譜測定肽質(zhì)量（MALDI-MS,ESI-MS)選擇肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)肽質(zhì)譜指紋圖肽質(zhì)量檢索解析碎片離子檢索酶切質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的策略4、質(zhì)譜法-應(yīng)用1)樣品元素組成分析2)無機(jī)、有機(jī)生物定性、定量分析3)復(fù)雜混合物的定性定量分析4)固體表面結(jié)構(gòu)和組成分析5)樣品中原子的同位素比現(xiàn)有鑒定技術(shù)面臨的最大問題是，它們都依賴于已知的蛋白質(zhì)或基因的序列作為檢測的基礎(chǔ)，通過比較來確定待測的蛋白質(zhì)。對于在已有數(shù)據(jù)庫中沒有記載的全新蛋白質(zhì)必須進(jìn)行“從頭測定”，一般是通過經(jīng)典的Edman降解法測定氮端序列或化學(xué)降解法測定碳端序列，這是困難繁瑣的任務(wù)

全新蛋白質(zhì)的鑒定傳統(tǒng)方法氨基酸組成分析蛋白質(zhì)微量測序分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。（四）蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)生化方法分子生物學(xué)方法遺傳學(xué)方法基于質(zhì)譜的方法

蛋白質(zhì)親和層析親和印跡免疫沉淀交聯(lián)

酵母雙雜交噬菌體展示生物傳感芯片質(zhì)譜蛋白質(zhì)工程中的定點誘變技術(shù)

研究技術(shù)傳統(tǒng)技術(shù)新技術(shù)

1989年Field和Song等人在酵母細(xì)胞中設(shè)計的分析蛋白質(zhì)相互作用的方法。

利用釀酒酵母的GAL4/Lex蛋白質(zhì)N-端和C-端分別融合的兩種蛋白質(zhì)相互作用可激活具有UAS（upstreamactivatingsequence，上游激活序列）的報告基因表達(dá)，從而判斷兩種蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用的方法。

1．酵母雙雜交系統(tǒng)（yeasttwo-hybridsystem）

根據(jù)BD來源的不同主要分為:

GAL4系統(tǒng)

LexA系統(tǒng)i.

GAL4蛋白質(zhì)功能：是一個轉(zhuǎn)錄因子，在酵母中控制半乳糖利用酶類基因的表達(dá)（這些基因的5’-端存在UAS序列），激活這些基因UAS的下游啟動子；ii.

GAL4結(jié)構(gòu)特征：存在兩個結(jié)構(gòu)域

N-端(1-147)具有UAS-DNA結(jié)合域(DNA-

bindingdomain,

BD)

C-端(768-881)具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptionalactivationdomain,AD)1)

GAL4系統(tǒng)

這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響，可單獨存在。但只有在兩者相互結(jié)合或通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時，才能呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活其報告基因UAS的下游啟動子，使啟動子下游基因（報告基因）得到轉(zhuǎn)錄。iii.

如果將兩個待測蛋白分別與這兩個結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白，并共表達(dá)于同一個酵母細(xì)胞內(nèi)。如果兩個待測蛋白間能發(fā)生相互作用，就會通過待測蛋白的橋梁作用使AD與BD靠近形成一個完整的轉(zhuǎn)錄激活因子，并激活相應(yīng)的報告基因表達(dá)。通過對報告基因表型的測定可以很容易地知道待測蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用。酵母的雙雜交系統(tǒng)示意圖2)酵母雙雜交系統(tǒng)的組成

(1)與BD融合的蛋白表達(dá)載體。被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白(bait)，融合的基因稱誘餌基因(2)與AD融合的蛋白表達(dá)載體。被其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白preyprotein/隨機(jī)蛋白庫libraryprotein(3)帶有一個或多個報告基因（能顯示誘餌和靶蛋白相互作用的基因）的宿主菌株。雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營養(yǎng)標(biāo)記基因，菌株則具有相應(yīng)的缺陷型。LacZreporter-Blue/WhiteScreeningHIS3reporter-ScreenonHis+mediaLEU2reporter-ScreenonLeu+mediaADE2reporter-ScreenonAde+mediaURA3reporter-ScreenonUra+media(candonegativeselectionbyaddingFOA)常用的報告基因酵母雙雜交工作原理酵母雙雜交模型3）主要特點和優(yōu)勢使蛋白質(zhì)表現(xiàn)型和基因型相聯(lián)系篩選cDNA文庫真實反應(yīng)體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用情況不需分離靶蛋白敏感性高4）應(yīng)用1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能2、利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖5）缺點1.假陽性結(jié)果2.假陰性結(jié)果3.限于核內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的相互作用

假陽性技術(shù)假陽性蛋白的非特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，激活報告基因

靶蛋白無需與誘餌蛋白結(jié)合就能誘導(dǎo)報告基因的轉(zhuǎn)錄

（這是大多數(shù)假陽性的誘因）生物學(xué)假陽性

能發(fā)生物理相互作用,但不與生理學(xué)相關(guān)假陰性

用酵母雙雜交技術(shù)檢測不到許多已知的相互作用。造成假陰性的原因有蛋白質(zhì)不正確折疊、亞細(xì)胞定位不準(zhǔn)、嵌合蛋白的降解或酵母中缺乏特定類型的翻譯后修飾等細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)1998年，Karimova等建立細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)，彌補(bǔ)了酵母雙雜交的缺陷。與酵母雙雜交的原理相似，該系統(tǒng)利用百日咳博代桿菌中編碼的鈣調(diào)蛋白依賴性腺苷酸環(huán)化酶的2個相對獨立的催化結(jié)構(gòu)域T18和T25，分別與待研究蛋白質(zhì)融合，在腺苷酸環(huán)化酶缺陷型大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，如果蛋白質(zhì)間存在相互作用，則T18和T25片段恢復(fù)完整結(jié)構(gòu)域，催化形成cAMP，從而激活作為報告基因的乳糖或麥芽糖操縱子的表達(dá)，產(chǎn)生可以識別的表型變化。細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)優(yōu)點研究周期短，操作簡單，擁有更大容量的篩選文庫，轉(zhuǎn)化效率高；選擇細(xì)菌作為篩選宿主，降低了對研究蛋白核定位的要求；且細(xì)菌遺傳體系的基因復(fù)雜性更小，與高等生物進(jìn)化距離更遠(yuǎn)，避免了內(nèi)源蛋白引起的假陽性現(xiàn)象，能得到一些用酵母雙雜交系統(tǒng)研究時無法得到的結(jié)果。2．噬菌體表面展示技術(shù)(phagedisplay)

以噬菌體為載體，把待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質(zhì)的基因，使其基因表達(dá)產(chǎn)物在噬菌體表面展示，進(jìn)而通過親和富集法篩選特異肽或蛋白質(zhì)的方法。噬菌體展示系統(tǒng)絲狀噬菌體展示系統(tǒng)λ噬菌體展示系統(tǒng)T4噬菌體展示系統(tǒng)T7噬菌體展示系統(tǒng)等絲狀噬菌體展示系統(tǒng)

基因組均為單鏈環(huán)狀DNA，大小約6.4kb，共編碼10個不同的外殼蛋白質(zhì)，與表面展示有關(guān)的蛋白質(zhì)主要是由基因Ⅲ(g3)和基因Ⅷ(g8)編碼的外殼蛋白gp3和gp8，分別可構(gòu)成gp3和gp8展示系統(tǒng)。gp3和gp8蛋白的N端均游離在外，外源肽通過柔性接頭（linker）與其N端連接，然后外源肽或蛋白質(zhì)以融合的形式表達(dá)出來并分泌到胞間質(zhì)內(nèi)，當(dāng)宿主蛋白酶切除信號肽后，融合蛋白組裝成熟，呈現(xiàn)在病毒粒子的表面。不影響和干擾噬菌體的生活周期，而且同時保持了外源蛋白天然構(gòu)象，并能被相應(yīng)的抗體或受體所識別噬菌體展示技術(shù)的原理LeadProteinLinkPIII融合蛋白PIII基因型表達(dá)型利用固相支持物上的抗體或受體，采用親和篩選法從噬菌體文庫中篩選出能結(jié)合篩選分子的目的噬菌體。外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，其編碼基因可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序推導(dǎo)出來。噬菌體表面展示的步驟1、不同基因分別被插入噬菌體基因組中。

2、分離純化的噬菌體只是展示一個蛋白，多肽或者抗體。收集所有的噬菌體就構(gòu)成一個文庫。

3、將噬菌體文庫與靶蛋白相互作用，篩選能與靶蛋白相互作用的噬菌體

重組噬菌粒的構(gòu)建示意圖噬菌粒表達(dá)載體pCANTAB-5E

蛋白文庫的構(gòu)建SolidphaseselectionwithimmunotubesBBBBBBvvImmunotubecoatedwithantigencoatedwithsteptavidinandbiotinylatedantigenBWashtoremoveunboundphageparticles.EluteboundphageAmplifyelutedphageRepeatselectionAnalyze a)ELISA b)Specificity c)Sequencing d)Affinity e)ActivityE.coli感染和擴(kuò)增

目的蛋白的富集篩選吸附-洗滌-洗脫-擴(kuò)增3～5輪103～105富集主要應(yīng)用篩選與特異抗體或受體相互作用的蛋白質(zhì)

研究抗體或受體的結(jié)合位點構(gòu)建隨機(jī)肽庫、抗體庫和蛋白文庫

改造和提高蛋白質(zhì)的生物學(xué)和免疫學(xué)特性

研究新型多肽藥物、疫苗和抗體

研究涉及到蛋白質(zhì)與核酸相互作用的生物學(xué)過程和新型的基因治療導(dǎo)向系統(tǒng)

3．基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相互作用研究方法靶蛋白制備

蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化

蛋白質(zhì)復(fù)合體的質(zhì)譜鑒定基本步驟：（1）親和層析耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

（2）免疫共沉淀耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

（3）生物傳感器耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

（4）串聯(lián)親和純化耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

（五）蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)

生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個不可缺少的部分。

構(gòu)建和分析雙向凝膠電泳圖譜

數(shù)據(jù)庫的搜索與構(gòu)建應(yīng)用

蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫是蛋白質(zhì)組研究水平的標(biāo)志和基礎(chǔ)瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大、種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。目前應(yīng)用最普遍的數(shù)據(jù)庫是NRDB和dbEST數(shù)據(jù)庫。NRDB數(shù)據(jù)庫是由NCBI創(chuàng)建的，是NCBI的BLAST搜索程序的默認(rèn)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫該數(shù)據(jù)庫是一個較完全的，包含最新信息的數(shù)據(jù)庫。

dbEST數(shù)據(jù)庫

由美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）和歐洲生物信息學(xué)研究所（EBI）共同編輯，包括許多生物體的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）

肽序列標(biāo)簽(PST)或部分序列信息最適合查尋數(shù)據(jù)庫說明WWW地址蛋白質(zhì)序列庫:SWISS-PROT內(nèi)容豐富,提示詳盡http://www.expasy.ch/sport/PIR較/pir/pir-psi.htmlTrEMBL(EMBL的翻譯)http://www.expasy.ch/sprot/OWL(非冗余庫)http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/OWL.html核苷酸數(shù)據(jù)庫:EMBL歐州分子生物學(xué)http://www.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db/ebi/topembl.htmlGenBank美國生物工程信息中心/Web/Search/index.htmldbESTCDNA序列標(biāo)記/dbEST/模體與域:PROSITE序列模體http://www.expasy.ch/sport/prosite.htmlBLOCKS保守序列http://www./ProDom蛋白質(zhì)域http://protein.toulouse.inra.fr/prodom.htmlSBASE蛋白質(zhì)域http://base.icgeb.trieste.it/sbase/二維電泳(2DPAGE):WORLD-2DPAGE國際2DPAGE庫的完整索引http://www.expasy.ch/ch2d/2d-index.htmlLinksto2DPAGEPhoretix公司的連絡(luò)表/links.htm2DWG二維電泳圖譜元庫/2dwgDB/Flicker成對電泳圖譜比較/flicker/三維結(jié)構(gòu)庫:PDB蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)庫/SWISS-MODEL從序列模建結(jié)構(gòu)http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.htmlSWISS-3DIMAGE三維結(jié)構(gòu)圖示http://www.expasy.ch/sw3d/DSSP二級結(jié)構(gòu)命名ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/dsspFSSP蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)家族ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/fssp/翻譯后修飾:O-GLYCBASE糖基化http://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE/PHOSPHOBASE磷酸化http://www.cbs.dtu.dk/databases/PhosphoBase/deltamass翻譯后修飾匯編.au/WWWDOCS/SVIMRDOCS/MassSpec/deltamassV2.html基因組庫:dblist基因組庫目列http://www.expasy.ch/amos-www-links.html#organismsGDB基因組庫/OMIM遺傳病表型/omim/GeneCards生物醫(yī)學(xué)知識http://bioinfo.weizmann.ac.il/cards/代謝庫:Boehringer圖代謝路徑圖http://www.expasy.ch/cgi-bin/search-biochem-indexENZYME酶及其反應(yīng)的命名http://www.expasy.ch/sprot/enzyme.htmlEcolyc大腸桿菌中間代謝/ecocyc/ecocyc.htmlHinCys嗜血流感中間代謝/ecocyc/hincyc.htmlWIT酶和代謝途徑/WIT/相互作用:GIF-DB果蠅發(fā)育中的基因相互作用http://gifts.univ-mrs.fr.GIF-DB/GIF-DB-home.htmlKEGG基因相互作用http://www.genome.ad.jp/keggDeletion酵母功能基因組/group/yeast-deletion-project/deletion.html

表3用于蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)庫搜索軟件屬性參數(shù)/軟件名稱WWW地址蛋白質(zhì)質(zhì)量+蛋白質(zhì)序列標(biāo)記PeptideSearchhttp://www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.htmlTagIdenthttp://expasy.hcuge.ch/sprot/tagident.html蛋白質(zhì)的肽質(zhì)印記:MassSearchhtt