植物內(nèi)流型鉀離子通道基因的研究進(jìn)展

鉀是植物生長所必需的大量因素，在植物生長發(fā)育過程中對植物生長發(fā)育具有重要的營養(yǎng)和生理作用。隨著人們對植物鉀吸收和利用的生理及分子機制研究的深入,發(fā)現(xiàn)植物根系對鉀的吸收涉及到兩類吸收系統(tǒng)——高親和性吸收系統(tǒng)和低親和性系統(tǒng)。高親和性吸收系統(tǒng)是植物在低鉀條件下(胞外K+濃度1～200μmol/L)的主要吸收途徑,是通過細(xì)胞膜上K+轉(zhuǎn)運載體系統(tǒng)來實現(xiàn)的一個主動轉(zhuǎn)運過程;而低親和性吸收系統(tǒng)則是植物在高鉀條件下(胞外K+濃度高于0.5～1.0mmol/L)的主要吸收途徑,是由細(xì)胞膜上K+通道蛋白所介導(dǎo)的一個被動轉(zhuǎn)運過程。鉀離子通道是植物吸收K+的重要途徑之一。SCHROEDER等利用膜片鉗技術(shù)于20世紀(jì)80年代首先在蠶豆細(xì)胞中證實了鉀離子通道的存在,隨后,通過采用酵母雙突變體互補法又從擬南芥、馬鈴薯、大麥和小麥等植物中分離得到多種類型的K+通道。根據(jù)通道對電勢依賴性及離子流方向的不同,鉀離子通道可分為:內(nèi)向流型鉀離子通道(K+in)和外向流型鉀離子通道(K+out)。這兩種K+通道具有不同的動力學(xué)特征,通常認(rèn)為是兩種蛋白,都具有電勢依賴性,其差異表現(xiàn)在它們的電壓、Ca2+和pH依賴性方面。這兩種K+通道存在于各種植物的細(xì)胞膜中,如保衛(wèi)細(xì)胞,糊粉層細(xì)胞,葉片細(xì)胞,莖組織,葉肉細(xì)胞和中柱等。已有研究表明,內(nèi)向整流型鉀離子通道是植物K+吸收的主要途徑,對其分子生物學(xué)的研究也較為清楚。植物內(nèi)向整流型鉀離子通道主要存在于細(xì)胞質(zhì)膜上,具有特殊的電勢依賴性。K+in通道主要有2項功能:(1)為低親和力K+吸收提供一條途徑,吸收由H+泵建立的膜電壓驅(qū)動;(2)調(diào)節(jié)膜傳導(dǎo)性和感受細(xì)胞內(nèi)外K+濃度梯度而影響膜電壓的控制。在細(xì)胞膜超極化的電壓條件下,內(nèi)流型鉀離子通道被打開,從而介導(dǎo)鉀離子流入胞內(nèi)和調(diào)控膜蛋白。植物細(xì)胞膜上的K+in通道對植物根,胚芽鞘,維管組織等部位的K+內(nèi)流,膜蛋白的調(diào)控,氣孔開閉等各種細(xì)胞功能中起著重要的作用。大麥、黑麥草和玉米等植物中的K+in對K+表現(xiàn)為低親和性,然而,在向日葵和擬南芥中,低鉀的情況下,K+內(nèi)流量和K+通道的活性都有所提高,表現(xiàn)為高親和性。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,目前已克隆出了許多與鉀離子吸收有關(guān)的通道基因。外源高親和性鉀通道基因的導(dǎo)入不僅可以提高肥料鉀和土壤緩效鉀的利用率,而且可以顯著增加植株的鉀含量,使植物產(chǎn)量和品質(zhì)得到較大幅度的提高,從而開辟利用外源基因改良植物營養(yǎng)遺傳特性的新途徑。1k+in通道基因到目前為止,已從多種植物或同種植物的不同組織器官中分離得到了許多K+in通道基因,這些通道基因的表達(dá)特性各有不同,常見的有兩種分類方法。SCHROEDER等根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的不同,把這些K+in通道基因分為KAT亞族和AKT亞族(表1)。ELIDE等根據(jù)內(nèi)流型鉀通道基因的結(jié)構(gòu)和DNA序列的分析,把它們分為4個大組(表2),其中Ⅲ組為弱內(nèi)向整流型鉀離子通道[7,8,9,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32]。2tyr-gly序列及-亞基這些K+in通道(圖1)具有S1～S6六個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個位于S5和S6之間的P結(jié)構(gòu)區(qū)域(又稱為H5區(qū)域)。S4是通道電壓敏感區(qū),是一個Arg/Lys-Xaa-Xaa-Arg/Lys重復(fù)序列區(qū),對跨膜電壓變化產(chǎn)生反應(yīng),導(dǎo)致通道門開放所必需的。P結(jié)構(gòu)區(qū)域是離子通道孔徑形成區(qū),含有離子結(jié)合部位,其中間在內(nèi),兩端暴露在外,呈β發(fā)夾狀。H5中GYGD片段的存在表明它是一個高度保守的K+選擇區(qū)。該區(qū)域氨基酸殘基的微小變化都會直接影響離子的選擇性與導(dǎo)度,如蘇氨酸和苯丙氨酸分別被絲氨酸替換時,對Rb+和NH4+的導(dǎo)度增加。在-COOH端有一個錨蛋白相關(guān)區(qū)(ANKY)和一個環(huán)核苷酸結(jié)合位點(NBS),錨蛋白區(qū)在環(huán)核苷酸結(jié)合位點的下游,與其它蛋白質(zhì)之間的相互作用有關(guān)。目前認(rèn)為錨蛋白相關(guān)區(qū)只存在AKT1及相近K+的通道,KAT1沒有ANKY。保守的N-端可能在亞基間及它們在胞質(zhì)集合裝配時起特異識別作用。具有生理功能的鉀離子通道可能是由4個分子量為65～100kD的α-亞基和一個β-亞基組成的同源四聚體(圖2),其中α-亞基上有P-回環(huán)形成的狹窄的選擇性過濾器(SF)(圖3)和電壓敏感器(VS)。X射線晶體學(xué)顯示,選擇性過濾器長1.2nm,孔徑約為0.3nm,K+脫水后(直徑約為0.26nm)恰好可以通過。過濾器中每一個亞基都存在著一個保守的TVGYG序列,每一個序列氨基酸上的羧基氧原子都指向孔道。每8個氧原子以一個近似方形棱鏡的形式包圍成一個K+適宜的結(jié)合位點,過濾器存在4個位點,從胞內(nèi)到胞外分別定義為位點1～4。K+通道一個獨特的結(jié)構(gòu)特征是孔道內(nèi)有一個部位可以膨脹到1.0nm,稱為中心腔,位于選擇性過濾器的胞內(nèi)側(cè),細(xì)胞膜的中間。中心腔中可以容納一個K+,其它空間則充滿了水。通道胞外側(cè)的出口處存在兩個適宜K+結(jié)合的位點。鉀離子通道孔的氨基酸序列是高度保守的,Tyr-Gly序列在離子選擇性中起到重要作用,離子通道對離子選擇性差異可能就在于Tyr-Gly序列在離子通道氨基酸序列上位置的不同。β-亞基具親水性,可能起到調(diào)節(jié)的作用。AKT1基因是1992年SENTENAC等于利用酵母的吸鉀缺陷突變體,從擬南芥cDNAA文庫中分離得到的,它是第一個克隆得到的植物K+通道基因。AKT1長2649bp,其中閱讀框為2517bp(核苷酸從58～2574),編碼838個氨基酸的蛋白質(zhì),相對分子質(zhì)量約為95.4KD,其-COOH端有錨蛋白區(qū)(ANK)且N-末端較短,為60個氨基酸,C-末端較長,有562個氨基酸組成。研究證明,AKT1與Shaker家族的結(jié)構(gòu)相似,它具有6個跨膜區(qū)域S1,S2,S3,S4,S5,S6及一個P(H5)結(jié)構(gòu)域。LKT1,ZMK1,QsAKT1,DKT1和AKT1結(jié)構(gòu)相似,其-COOH端都有錨蛋白區(qū)。KAT1是1992年,ANDERSON等通過應(yīng)用吸鉀缺失的酵母突變體,通過功能互補法從擬南芥中分離得到的植物K+通道基因。其基因的閱讀框含有2031個核苷酸,編碼677個氨基酸,相對分子量約為78kD。該蛋白可能有7個跨膜結(jié)構(gòu),其中有6個結(jié)構(gòu)成串排列在多肽的N端,這一結(jié)構(gòu)是所有電壓敏感Shaker族K+通道的結(jié)構(gòu)特征。KST1是1995年,MUELLER-ROEBER等從是從馬鈴薯的保衛(wèi)細(xì)胞中分離得到的鉀通道基因。它長約2381bp,可編碼689個氨基酸的多肽。其結(jié)構(gòu)與Shaker型的K+通道類似,所編碼的蛋白也有S1,S2,S3,S4,S5,S6和H5區(qū)。KST1,SIRK,KZM1,KPT1和KAT1結(jié)構(gòu)相似,在-COOH端沒有錨蛋白相關(guān)區(qū)[5,8,9,17,18,24,28]。AKT2是利用AKT1作為探針,從擬南芥cDNA文庫中克隆得到的。其基因編碼由802個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì),相對分子量約為91.3kD。AKT2的多肽序列有6個可能的跨膜結(jié)構(gòu),為S1,S2,S3,S4,S5,S6及一個P(H5)結(jié)構(gòu)域,及包含有6個糖基化位點和15個磷酸化位點。氨基酸糖基化位點和磷酸化位點是跨膜蛋白所特有。ZMK2,SPICK1SPICK2與AKT2相似,它們都編碼弱內(nèi)向整流型鉀離子通道,其基因產(chǎn)物在-COOH端具有錨蛋白相關(guān)區(qū)[7,8,20,23,29,30,31]。AtKC1和KDC1是分別從擬南芥和胡蘿卜根中分離和克隆出來的,他們的基因產(chǎn)物均沒有錨蛋白相關(guān)區(qū)。3k+吸收促進(jìn)k-ras1的表達(dá)AKT1基因在擬南芥中表達(dá)部位主要集中在成熟根的表皮、皮層和內(nèi)皮層,葉組織中則很少,有可能參與土壤溶液的K+吸收。較KAT1而言,其對K+有更高的選擇性,其選擇性依次為:K+>Rb+>Na+>Li+,通透比P+I/P+Hb是KAT1的10倍,對cGMP敏感。AKT1通道能促進(jìn)植物對K+的吸收,影響根細(xì)胞的生長發(fā)育。與野生型相比,插入T-DNA的AKT1基因的突變體植株能夠生長在K+濃度為微摩爾級的介質(zhì)上,這表明AKT1類的鉀離子通道主要吸收微摩爾級的鉀離子。LKT1是從番茄根毛特化的cDNA文庫中克隆出來的,在根毛中表達(dá)強烈。其編碼的多肽中有97%的氨基酸序列與馬鈴薯的SKT1一致,且它們在生理功能上也有相似性。ZMK1通道基因是從玉米胚芽鞘中分離得到的,主要在皮層表達(dá)。在卵母細(xì)胞中的表達(dá)表明,ZMK1通過外部酸化激活鉀離子內(nèi)向整流通道。QsAKT1通道基因來源于水稻特化的cDNA文庫,主要在根部表達(dá),葉片中也有少量表達(dá)。其表達(dá)具有明顯地細(xì)胞特異性,如:在根部,它在表皮和內(nèi)皮層細(xì)胞中表達(dá)強烈,而在脈管系統(tǒng)和外皮層細(xì)胞中表達(dá)量較少。有研究表明,其在鹽脅迫下水稻的K+吸收過程中起到重要作用。DKT1是由ELIDE等人從胡蘿卜中分離得到的一種內(nèi)向整流型鉀離子通道基因,主要在葉片中表達(dá),在根、莖、子葉等部位也有表達(dá)。其與AKT1有82%的同源性,與LKT1有85%,可能參與了植物營養(yǎng)物質(zhì)吸收和其他一些生理過程。KAT1的表達(dá)具有組織特異性,在擬南芥根、莖保衛(wèi)細(xì)胞和液泡組織中表達(dá)。TEA+或Ba2+等K+通道專一性抑制劑對其影響較大,秋水仙素能夠降低KAT1的表達(dá)。SCHACHTMAN等于1992年報道,在表達(dá)KAT1的卵母細(xì)胞中,其表達(dá)的內(nèi)流通道在-130mV時,10mmol/L的TEA+或Ba2+可分別抑制K+內(nèi)流的81%和70%。KAT1可能在調(diào)節(jié)氣孔開放和K+向液泡中轉(zhuǎn)運起作用,而不是直接從土壤中吸收K+在卵母細(xì)胞中KAT1的離子選擇性是K+>NH4+>Rb+>Na+-Li+-Cs+。KAT1對NH4+有較顯著的通透性,NH4+可能會抑制KAT1對K+的吸收,KAT1通道也可能是NH4+進(jìn)入細(xì)胞的途徑之一。KST1與KAT1有81%的相似性,相同的氨基酸高達(dá)63%。KST1主要在花和葉中表達(dá),而在莖節(jié)、塊莖和根中則不表達(dá)。其基因產(chǎn)物主要存在于氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞中參與氣孔的開閉。它對抑制劑Cs+高度敏感,并且受到細(xì)胞外部pH和細(xì)胞內(nèi)部ATP的影響。在卵母細(xì)胞中表達(dá)表明,KST1對的K+高度選擇性與SKT1相似,選擇性吸收順序是:K+>Rb+>NH4+>Rb+>Na+,Li+。但是與SKT1相比,KST1的通道激活時間是呈二次指數(shù)級增長而不是多次指數(shù)級增長;KST1和SKT1的半激活時間分別是:-140mV條件下(122±52)ms和-100mV條件下(217±61)ms,激活通道的電壓比SKT1低。SIRK是PRATELLI等人從葡萄藤植物中分離得到的一種K+in通道基因。它在葡萄藤的保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá),在擬南芥的木質(zhì)部薄壁組織中也有表達(dá)。SIRK基因與KAT類型的內(nèi)流型鉀離子通道基因有高度的相似性。SIRK的電壓門值為2.8,KAT2的為2.5,KAT1的為1.6;SIRK的半激活電壓為-161mV,KAT2的為-152mV,KAT1的為-130mV;此外,0.1mmol/LCs+的存在,就能夠抑制SIRK通道K+的流入?？梢?與KAT1相比,SIRK的電壓門特性與KAT2的很相似,與KAT2的功能特性很相似。SIRK通道的選擇性依次為:K+>Rb+>Na+。KZM1是來源于玉米的一種內(nèi)向整流型鉀離子通道,主要在玉米的保衛(wèi)細(xì)胞和脈管系統(tǒng)表達(dá)。其功能可能與KAT2相似,但較KAT2而言,它不受外部環(huán)境酸化的影響。KPT1是由Hedrich等從白楊中分離得到的,在保衛(wèi)細(xì)胞和芽部位表達(dá)。其基因產(chǎn)物可能與保衛(wèi)細(xì)胞的開啟和芽生長時K+的吸收過程有關(guān)。AKT2與AKT1有60%的同源性,但AKT2主要在葉片中表達(dá),而AKT1主要在根部表達(dá),其能在卵母細(xì)胞中表達(dá)并且具有轉(zhuǎn)運K+的作用,是電壓門控的內(nèi)向整流型K+通道。ZMK2是從玉米胚芽鞘中分離得到,在脈管系統(tǒng)表達(dá)。其是依電壓獨立性及質(zhì)子禁止性通道方式調(diào)節(jié)K+的內(nèi)流和外流。SPICK1和SPICK2是從雨樹(Samaneasaman)中分離得到的,在葉片中表達(dá)。其受到光和自身生物鐘的調(diào)控,此外,SPICK2還受到磷酸化的調(diào)控。AtKC1是REINTANZ等從擬南芥中分離克隆得到的一個新的α-亞基類K+通道基因,主要在根毛區(qū)和根的內(nèi)皮層表達(dá)。它的α-亞基是根毛鉀離子吸收通道的重要組成單位。KDC1是從胡蘿卜根中分離和克隆出來的,在胡蘿卜根毛細(xì)胞中有較高水平的表達(dá)。它不能單獨在卵母細(xì)胞中表達(dá),當(dāng)它作異源表達(dá)時,它是一個電壓和H+依賴性的內(nèi)向整合型鉀離子通道,其基因產(chǎn)物能夠介導(dǎo)K+流的產(chǎn)生。4不同cs+對轉(zhuǎn)植株的保水性人們已對從植物中克隆得到的多個K+in通道基因進(jìn)行了較為深入的研究,并通過基因工程技術(shù),將KAT1和AKT1鉀通道基因相繼轉(zhuǎn)入擬南芥、水稻和煙草中,使轉(zhuǎn)基因植株在吸鉀速率和對鉀的累積能力等方面與對照相比都有明顯的提高。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,ICHIDA等將KAT1鉀通道基因轉(zhuǎn)入擬南芥植株中。通過對轉(zhuǎn)基因植株的研究發(fā)現(xiàn),表達(dá)KAT1K+in通道基因的擬南芥植株的保衛(wèi)細(xì)