四、翻譯水平的調(diào)節(jié)

1整理課件2整理課件遺傳密碼的性質(zhì)3整理課件通過校正tRNA的方式校正基因的堿基缺失和插入4整理課件為催化DNA拓撲學(xué)異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)變的酶之總稱。催化DNA鏈斷開和結(jié)合的偶聯(lián)反響，為了分析體外反響機制，用環(huán)狀DNA為底物。在閉環(huán)狀雙鏈DNA的拓撲學(xué)轉(zhuǎn)變中，要暫時的將DNA的一個鏈或兩個鏈切斷，根據(jù)異構(gòu)體化的方式而分為二個型。切斷一個鏈而改變拓撲結(jié)構(gòu)的稱為Ⅰ型拓撲異構(gòu)酶〔top-oisomeraseⅠ〕，通過切斷二個鏈來進行的稱為Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶〔topoisomeraseⅡ〕。屬于Ⅰ型的拓撲異構(gòu)酶，有大腸桿菌的ω蛋白〔ω-protein，由分子量11萬的單個多肽鏈所成〕及各種真核細胞中存在的切斷-結(jié)合酶〔nicking-closingenzyme，分子量約6萬5千—7萬的及分子量約10萬的〕。Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶，有存在于細菌中的DNA促旋酶、噬菌體T4的拓撲異構(gòu)酶Ⅱ以及真核細胞中依賴ATP的拓撲異構(gòu)酶Ⅱ等。5整理課件6整理課件在Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶中，DNA促旋酶可單獨催化閉環(huán)狀DNA產(chǎn)生超螺旋，這是獨特的。

7整理課件(一)

翻譯內(nèi)含子(translationalintron)8整理課件

T4DNA拓撲異構(gòu)酶在ATP存在下，可使超螺旋DNA變成松散的DNA，其中有DNA雙鏈的斷裂，鏈的旋轉(zhuǎn)，再縫合。全酶由三種亞基六個蛋白質(zhì)分子組成，分別由基因39、基因52和基因60編碼?；?9編碼的亞基有520個氨基酸，ATP酶活性。基因52編碼的亞基有441個氨基酸，松散DNA超螺旋。基因60編碼的亞基有160個氨基酸，結(jié)合各亞基，協(xié)調(diào)功能。這三個亞基的蛋白質(zhì)順序已分析清楚。已經(jīng)獲得基因39、52、60的DNA克隆，并在大腸桿菌中高效表達蛋白質(zhì)。9整理課件T4DNAtopoisomerase:anewATP-dependentenzymeessentialforinitiationofT4bacteriophageDNAreplicationNature281,456-461(11October1979)

LeroyF.

Liu,Chung-Cheng

Liu

&

BruceM.

AlbertsDepartmentofBiochemistryandBiophysics,UniversityofCalifornia,SanFrancisco,California9414310整理課件NucleotidesequenceofatypeIIDNAtopoisomerasegene.BacteriophageT4gene39NucleicAcidsResearch,1986,Vol.14,No.197751-7765WaiMunHuangDepartmentofCellular,ViralandMolecularBiology,UniversityofUtahMedicalCenterSaltLakeCity,UT84132,USA

11整理課件The52-proteinsubunitofT4DNAtopoisomeraseishomologoustothegyrA-proteinofgyrase.NucleicAcidsRes.1986September25;14(18):7379–7390.WMHuang12整理課件對基因60的核苷酸序列分析后，難以排出適宜的閱讀框架，與它表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸順序?qū)φ?，發(fā)現(xiàn)在第46位甘氨酸和第47位亮氨酸密碼子之間，有50個核苷酸插入，其中緊跟第46位甘氨酸密碼的是一個終止密碼TAG。DNA有義鏈5’－GGCTAG‥‥‥CTC－3’mRNA5’－GGCUAG‥‥‥CTC－3’蛋白質(zhì)序列‥‥甘氨酸亮氨酸‥第46位第47位13整理課件

在細胞中，mRNA中是否也有這段插入序列？

人工合成基因60編碼區(qū)的30聚多核苷酸和插入序列的30聚多核苷酸作為兩種探針，分別檢測T4感染細胞的RNA，雜交分析，兩種探針完全給出相同的雜交圖譜一條帶，實際上細胞中只有一種RNA，沒有發(fā)現(xiàn)有mRNA剪切加工的現(xiàn)象。對細胞中基因60的mRNA作核苷酸序列分析，都發(fā)現(xiàn)有50核苷酸插入序列的存在。14整理課件RNA電泳轉(zhuǎn)移雜交分析正極負極共三條帶編碼區(qū)探針插入序列探針DNA轉(zhuǎn)錄剪接+15整理課件無論哪種探針都只有一條相同的帶，說明細胞中只有一種RNA16整理課件普遍性：

1.將50個核苷酸序列插入到LacZ的適當(dāng)編碼序列內(nèi)，在翻譯過程中，大腸桿菌核糖體同樣可以跳過這個非翻譯序列，產(chǎn)生完整的β半乳糖苷酶。2.在酵母表達系統(tǒng)中，酵母核糖體也能跳過這段序列，產(chǎn)生完整的蛋白質(zhì)。17整理課件意義：

設(shè)想在翻譯水平上調(diào)控，形成不同的二級結(jié)構(gòu)。18整理課件Evaluationofthemutationssuggests5requirementsforefficientribosomehopping:Aminoacidresidues17to32ofthenascentpeptideTerminationcodonrightaftercodon47Ashorthairpinatthetake-offsiteIdentitybetweencodons47and48A50ntspacingbetweencodons47and4819整理課件Science,Vol239,Issue4843,1005-1012,

1988ApersistentuntranslatedsequencewithinbacteriophageT4DNAtopoisomerasegene60WMHuang,SZAo,SCasjens,ROrlandi,RZeikus,RWeiss,DWinge,andMFangDepartmentofCellular,ViralandMolecularBiology,UniversityofUtahMedicalCenter,SaltLakeCity84132

20整理課件abstractA50-nucleotideuntranslatedregionisshowntobepresentwithinthecodingsequenceofEscherichiacolibacteriophageT4gene60,whichencodesoneofthesubunitsforitstypeIIDNAtopoisomerase.ThisinterruptionispartofthetranscribedmessengerRNAandappearsnottoberemovedbeforetranslation.Thus,theusualcolinearitybetweenmessengerRNAandtheencodedproteinsequenceapparentlydoesnotexistinthiscase.Theinterruptionisbracketedbyadirectrepeatoffivebasepairs.Amechanismisproposedinwhichfoldingoftheuntranslatedregionbringstogethercodonsseparatedbytheinterruptionsothattheelongatingribosomemayskipthe50nucleotidesduringtranslation.Thealternativepossibility,thattheproteinisefficientlytranslatedfromaveryminorandundetectableformofprocessedmessengerRNA,seemsunlikely,buthasnotbeencompletelyruledout.21整理課件〔二〕microRNA22整理課件〔三〕蛋白質(zhì)合成過程的調(diào)節(jié)

1.珠蛋白合成調(diào)控-eIF2磷酸化對翻譯的調(diào)控：

23整理課件紅細胞體積很小，直徑只有7～8μm，形如圓盤，中間下凹，邊緣較厚。它具有彈性和可塑性，在通過直徑比它還小的毛細血管時，可以改變形狀，通過后仍恢復(fù)原形。

正常成熟的紅細胞沒有細胞核，也沒有高爾基體和線粒體等細胞器，但它仍具有代謝功能。紅細胞內(nèi)充滿著豐富的血紅蛋白，血紅蛋白約占細胞重量的32％，水占64％，其余4％為脂質(zhì)、糖類和各種電解質(zhì)。24整理課件25整理課件26整理課件27整理課件

哺乳動物網(wǎng)織紅細胞蛋白質(zhì)合成調(diào)控研究得較為詳細。網(wǎng)織紅細胞是紅細胞成熟前發(fā)育的最后階段，由它合成的蛋白質(zhì)90％以上是珠蛋白。珠蛋白鐵＋卟啉

血紅素血紅蛋白28整理課件血紅素與珠蛋白的合成以平行速度進行，如完整細胞中缺鐵或網(wǎng)織紅細胞內(nèi)缺血紅素，合成蛋白質(zhì)的速度下降到原來的10％。29整理課件血紅素缺乏造成的影響是生成了一個抑制物血紅素調(diào)控阻遏物(HCR)。分子量80,000-90,000，含有蛋白激酶的性質(zhì)，可磷酰化eIF-2，80S起始復(fù)合物不能形成，參加外源的eIF-2或HCR抗體可克服HCR的影響。有一種專一性的磷酸酶可以催化這個逆反響。30整理課件31整理課件32整理課件2.酵母eIF-2的磷酸化對GCN4mRNA翻譯起始的激活作用33整理課件啤酒酵母的GCN4是一個轉(zhuǎn)錄因子，它能特異地結(jié)合與許多氨基酸合成酶基因的啟動子TGACTC上，誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄。GCN4蛋白質(zhì)合成量的增多是由于GCN4mRNA在翻譯時被激活。34整理課件35整理課件上游的AUG起始密碼子的存在抑制下游ORF的翻譯在eIF-2正常水平時，上游的每個ORF都能進行翻譯，GCN4的翻譯幾率較少36整理課件在氨基酸饑餓的條件下，磷酸化的eIF-2增多，活化的eIF-2減少，翻譯起始復(fù)合物的再循環(huán)必然受到限制。翻譯完uORF1后的核糖體迅速滑過其它uORF，到達GCN4-ORF開始翻譯，逃避了其它uORF的抑制。37整理課件五、翻譯后水平的調(diào)節(jié)

〔一〕蛋白質(zhì)的成熟1.

多余序列的切除胰島素原的激活38整理課件2.

蛋白質(zhì)內(nèi)含子Intein

蛋白質(zhì)內(nèi)含子是蛋白質(zhì)中的一段多肽鏈，靠自我剪切的方式從前體蛋白中別離出來，同時兩端以肽鍵的方式相連。39整理課件①特征序列

A、B、C、D、E、F、G六個保守的motif40整理課件Ser類型②自我剪切過程41整理課件

Cys類型42整理課件用途構(gòu)建表達載體，產(chǎn)生蛋白質(zhì)。43整理課件NEWENGLANDBioLabsINC.nebIMPACT-CNSystem44整理課件45整理課件46整理課件47整理課件48整理課件〔二〕蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的正確形成:

分子伴侶1.Anfinsen的牛胰核糖核酸酶變性復(fù)性試驗

49整理課件RNaseA

50整理課件50年代末完成全序列測定的第一個蛋白質(zhì)，124個氨基酸，MW12600，4對二硫鍵。在8mol/L尿素，β-巰基乙醇存在時，二硫鍵被破壞，變?yōu)樗缮⒔Y(jié)構(gòu)。透析，除去尿素和β-巰基乙醇，再參加氧化劑，那么重新恢復(fù)構(gòu)象。51整理課件52整理課件53整理課件54整理課件蛋白質(zhì)自組裝(Selfassembly)假說

第一階段是成核〔nucleation)。由于擠壓效應(yīng)或疏水作用，多肽鏈中的一些小肽段迅速行成螺旋，作為進一步折疊的核心，稱為核區(qū)。第二階段是折卷〔collapse)。已成為核的結(jié)構(gòu)，隨后散落成為較大的超二級結(jié)構(gòu)單元的集合體，包括一些β-折疊片和β-轉(zhuǎn)角的形成。第三階段是凝集〔condensation)。上述集合體在原子水平上凝集，形成致密的三級結(jié)構(gòu)。55整理課件56整理課件“這個實驗出色地證明了蛋白質(zhì)的功能取決于特定的天然構(gòu)象，而規(guī)定其構(gòu)象所需要的信息包含在它的氨基酸序列中。〞摘自?根底生物化學(xué)?〔高等教育出版社，2001.7)57整理課件ChristianB.Anfinsen(USA)因此獲得1972年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎。58整理課件問題：①特例：RNase的超穩(wěn)定性。59整理課件②蛋白質(zhì)的合成過程：蛋白質(zhì)合成中，首先合成N端，再向C端延伸。在水相中，親水的力量迫使多肽鏈疏水的基團聚集于內(nèi)部，親水基團位于外部。新生肽鍵的折疊在合成早期業(yè)已開始，隨肽鍵的延伸同時進行折疊，形成某種結(jié)構(gòu)。這與一條變形伸展的完整肽鍵的重折疊的情況是完全不同的。60整理課件發(fā)現(xiàn)過程2.Molecularchaperone的發(fā)現(xiàn)過程及定義

61整理課件1962年，意大利生物學(xué)家F.M.Ritossa在研究果蠅(Drosophila)的發(fā)育時，發(fā)現(xiàn):當(dāng)培養(yǎng)果蠅的溫度從正常的25℃上升到32℃時，幼蟲(larvae)細胞中的一些巨型染色體上的新的位點變得異常活潑。研究說明，溫度的升高促使一些新基因的表達。這就是熱激反響〔heat-shockresponse)的發(fā)現(xiàn)。62整理課件定義Themolecularchaperoneconcept.

EllisRJ.

DepartmentofBiologicalSciences,UniversityofWarwick,Coventry,UK.

Molecularchaperonesareaubiquitousfamilyofcellularproteinswhichmediatethecorrectfoldingofotherpolypeptides,andinsomecasestheirassemblyintooligomericstructures,butwhicharenotcomponentsofthosefinalstructures.63整理課件一類相互之間沒有關(guān)系的蛋白質(zhì)。它們的功能是幫助多肽結(jié)構(gòu)的其它物質(zhì)在體內(nèi)進行正確的非共價的組裝，并且不是組裝完成的結(jié)構(gòu)在發(fā)揮其正常的生物功能的組成局部。64整理課件中國科學(xué)院生物物理研究所的王志珍院士65整理課件分子伴侶幫助新生肽鏈正確折疊--助人為樂的分子伴侶太太很快出現(xiàn)在需要她盡力而為的場所〔新生肽鏈的折疊，越膜，應(yīng)激反響等情況〕，她主動去發(fā)現(xiàn)她應(yīng)該幫助的正在成長的新生肽姑娘〔識別折疊中間物〕，熱情地伸出友誼之手〔相互作用和結(jié)合〕，并發(fā)出警戒之言"不！不！別往哪兒走！"，防止她們誤入歧途掉進不可自拔的死亡深淵〔防止錯誤的相互作用導(dǎo)致的無效折疊和不可逆聚集〕，從而幫助她們沿著朝向正確目標(biāo)的光明大道前進〔有利于有效折疊成功能蛋白的正確折疊途徑〕。新生肽姑娘健康地成長〔正確折疊〕。折疊好的蛋白質(zhì)小姐愉快地，昂首闊步地準備去做自己的奉獻〔折疊成特定的空間構(gòu)并獲得生物活性的功能蛋白〕。66整理課件3.分子伴侶的種類

a.分子內(nèi)分子伴侶intramolecularchaperone體內(nèi)許多蛋白質(zhì)都以前導(dǎo)肽的前體形式合成，前導(dǎo)肽在蛋白質(zhì)折疊中具有分子伴侶的功能。b.分子伴侶67整理課件分子伴侶的分類和分布分類種屬細胞內(nèi)的定位核質(zhì)蛋白家族Nucleoplasmin真核生物細胞核基質(zhì)ProteinXLNO-38真核生物細胞核基質(zhì)NuleoplasminS真核生物細胞核基質(zhì)Hsp70Hsp70(Hsp40、Hsp24)所有生物細胞質(zhì)和細胞骨架，熱休克后移至細胞核及核仁質(zhì)膜上；哺乳動物線粒體DnaK(DnaJ、GrpE)大腸桿菌細胞質(zhì)Ssa1-4SsB1SsC1SsD1酵母細胞質(zhì)和線粒體Bip哺乳動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Hsp60家族GroEL(GroES)大腸桿菌細胞質(zhì)Cpn60(cpn10)真核細胞線粒體和葉綠體基質(zhì)RBP植物葉綠體68整理課件分類種屬細胞內(nèi)的定位TCP-1家族TF55古細菌細胞質(zhì)Tric(TCP-1）真核生物細胞質(zhì)Hsp90家族Hsp90哺乳動物細胞質(zhì)Hsp83,Hsp87酵母和果蠅細胞質(zhì)Grp94哺乳動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Hsp100家族Hsp104酵母細胞質(zhì)和核、核仁中ClpX大腸桿菌細胞質(zhì)69整理課件1)伴侶素家族〔chaperonin,Cpn〕Cpn家族是具有獨特的雙層7-9元環(huán)狀結(jié)構(gòu)的寡聚蛋白〔Hemminngwen1988;Cheng1989〕，它們以依賴ATP的方式促進體內(nèi)正常和應(yīng)急條件下的蛋白質(zhì)折疊。Cpns又分為兩組：GroEL(Hsp60)家族和TriC家族。GroEL型的Cpns存在于真細菌、線粒體和葉綠體中，由雙層7個亞基組成的圓環(huán)組成，每個亞基分子量約為60Ku。它們在體內(nèi)與一種輔助因子，如E.coli中的GroES，協(xié)同作用以幫助蛋白折疊。除了葉綠體中的類似物外，這些蛋白是應(yīng)急反響誘導(dǎo)的。人們對GroEL和GroES的結(jié)構(gòu)、功能及其作用機制做了十分詳盡的研究。TRiC型〔TCP-1環(huán)狀復(fù)合物〕存在于古細菌和真核細胞質(zhì)中，由雙層8或9元環(huán)組成，亞基分子量約為55K，與小鼠中TCP-1尾復(fù)合蛋白〔TCP-1tailcomplexprotein〕有同源性。這種Cpn沒有類似GroES的輔助因子，而且只有古細菌中的成員有應(yīng)急誘導(dǎo)性；70整理課件ThestructureofE.coliGroELheatshockprotein(hsp).Thereare14subunitsoftheGroEL.AttachedtotheapicaldomainistheGroES.Theapicalregionisalsocapableofpolypeptidebinding.Thelowerregion,(circled,bottom)isconcernedwithATPbinding.71整理課件GroEL/GroES復(fù)合體的高級結(jié)構(gòu)72整理課件73整理課件74整理課件75整理課件2)應(yīng)激蛋白70家族(Stress-70family)又稱為熱休克蛋白70家族〔Hsp70family〕，是一類分子量約70Ku的高度保守的ATP酶，廣泛地存在于原核和真核細胞中，包括大腸桿菌胞漿中的DnaK/DnaJ，高等生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Bip、Hsc1、Hsc2、Hsc4或hsc70，胞漿中的Hsp70、Hsp68和Ssal4p，線粒體中的Ssclp、Hsp70等。在細胞應(yīng)急和非應(yīng)急條件下的蛋白質(zhì)代謝，如蛋白質(zhì)的從頭折疊〔denovoproteinfolding)、跨膜運輸、錯誤折疊多肽的降解及其調(diào)控過程中有重要的作用。在體內(nèi)，Hsp70家族成員的主要功能是以ATP依賴的方式結(jié)合未折疊多肽鏈的疏水區(qū)以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的未折疊狀態(tài)，再通過有控制的釋放幫助其折疊〔Hartl1996〕。76整理課件3)應(yīng)激蛋白90家族(Stress-90family)即熱休克蛋白90家族〔Hsp90family〕，分子量在90Ku左右，包括大腸桿菌胞漿中的HtpG，酵母胞漿中的Hsp83與Hsc83，果蠅胞漿中的Hsp83，以及哺乳類胞漿中的Hsp90與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Grp94〔Erp90或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)素endoplasmin〕等。Hsp90可以與胞漿中的類固醇激素受體結(jié)合，封閉受體的DNA結(jié)合域，阻礙其對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的激活作用，使之保持在天然的非活性狀態(tài)，但hsp90的結(jié)合也使受體保持著對激素配體的高親和力。hsp90還與Ras信號途徑中許多信號分子的折疊與組裝密切相關(guān)，主要是hsp90的結(jié)合與解離，介導(dǎo)了這些分子在非活性形式與活性形式間的轉(zhuǎn)化。如轉(zhuǎn)化型酪氨酸激酶pp60v-src或在一定條件下，從hsp90等與之形成的復(fù)合物中釋放，才能轉(zhuǎn)位至胞膜，行使激酶的活性功能。Casein(CKII)和el/f-2a是兩種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其中Casein(CKII)與細胞生長和細胞周期有關(guān)，el/f-2a激酶那么調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成，兩者均可與hsp90及其他分子伴侶形成復(fù)合物。除hsp90以外，其他分子伴侶如hsp70,PPIs等都影響了受體分子的激活過程。77整理課件4)其他種類的分子伴侶包括核質(zhì)素、T受體結(jié)合蛋白(TRAP)、大腸桿菌的SecB和觸發(fā)因子〔triggerfactor〕及PapD、噬菌體編碼的支架蛋白〔scaffoldingproteins〕等。分子伴侶不僅與胞內(nèi)蛋白的折疊與組裝密切相關(guān)，影響到蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運、定位或分泌；而且與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的信號分子的活性狀態(tài)與活性行為相關(guān)連，具有重要的生理意義〔Bohen1995,Pratt1997〕。78整理課件c.酶1)肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶Peptidylprolylisomerases(PPIases)acceleratecis-transisomerizationofProresiduesduringproteinfolding.

79整理課件80整理課件2)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶?真核生物的PDI主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細菌中的類似物是Dsb家族，位于細菌外周質(zhì)〔periplasm〕，通過催化巰基與二硫鍵的交換反響，從而催化蛋白質(zhì)二硫鍵的形成、復(fù)原〔斷裂〕或重排〔異構(gòu)化〕。在蛋白質(zhì)折疊過程中，主要催化含有二硫鍵的膜蛋白或分泌蛋白的正確折疊。81整理課件82整理課件4.分子伴侶的作用機制

Example：ChaperoneringsinproteinfoldinganddegradationArthurL.Horwich

,EilikaU.Weber-Ban,andDanielFinleyPNASVol.96,Issue20,11033-11040,September28,1999

83整理課件84整理課件返回85整理課件86整理課件87整理課件ProteinfoldingwithintheER

88整理課件89整理課件90整理課件5.分子伴侶的功能91整理課件蛋白質(zhì)和新生肽的折疊模型新生肽鏈未折疊肽鏈復(fù)合物中介降解產(chǎn)物正常功能的蛋白質(zhì)Aggregates無效的錯誤折疊正確折疊釋放伴侶分子并折疊被降解識別并結(jié)合分子伴侶92整理課件

由于許多蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)的形成需要分子伴侶，所以其生物學(xué)功能廣泛。a.α-crystallin眼睛晶狀體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，與其它晶狀體蛋白結(jié)合以防止它們老化和沉淀，保持晶狀體澄清和必要的折光度。b.Hsp60.Hsp70幫助蛋白質(zhì)進入線粒體。93整理課件c.SecBE.coli中維持新生肽的疏松狀態(tài)使其可以穿過質(zhì)膜而運輸。d.PapD位于細菌間質(zhì)中，與P鞭毛蛋白亞基結(jié)合防止它們在周質(zhì)中聚合，從而促進正確組裝P鞭毛。e.Rb.視網(wǎng)膜母細胞瘤抑制基因是某些轉(zhuǎn)錄因子的分子伴侶。94整理課件瘋牛病、老年性癡呆癥、囊性纖維病變、家族性高膽固醇癥、家族性淀粉樣蛋白癥、某些腫瘤、白內(nèi)障等等都是“折疊病〞。95整理課件96整理課件97整理課件Prion98整理課件99整理課件100整理課件蛋白質(zhì)合成：蛋白質(zhì)氨基酸101整理課件102整理課件第二十一種蛋白質(zhì)氨基酸：硒代半胱氨酸Selenocysteine〔Sec〕103整理課件Severalenzymes(forexample,glutathioneperoxidase谷胱甘肽過氧化酶(GSHPx)

,tetraikiodothyronine5'deiodinaseandformatedehydrogenase)containtheunusualaminoacid104整理課件105整理課件由UGA編碼Sec，在動物(貓、牛和鼠等)和大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)

106整理課件甲狀腺分泌甲狀腺激素，調(diào)控體內(nèi)各種化學(xué)反響的速度〔代謝速率〕。甲狀腺通過兩種方式影響機體代謝率：刺激幾乎所有組織合成蛋白質(zhì)；增加細胞耗氧量，細胞負擔(dān)加重，器官代謝加快。

107整理課件108整理課件甲狀腺激素存在方式有兩種：一種是甲狀腺素〔T4〕，在甲狀腺內(nèi)產(chǎn)生，存在時間短，對機體代謝率影響較小。T4在肝臟及其他臟器轉(zhuǎn)化為有代謝活性的另一種形式甲狀腺激素，叫三碘甲狀腺原氨酸〔T3〕。約80％有活性的激素在T4的轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生，剩余20％由甲狀腺自身產(chǎn)生。109整理課件T4的脫碘反響是由脫碘酶的催化完成110整理課件I型脫碘酶的cDNA序列和蛋白一級結(jié)構(gòu)

111整理課件三種脫碘酶都是含硒酶

112整理課件脫碘機理113整理課件第二十二種蛋白質(zhì)氨基酸：114整理課件115整理課件甲烷菌分解甲氨(CH3NH2)，而產(chǎn)生甲烷。116整理課件October16,2002Identificationofthe22ndgenetically-encodedaminoacidinamethanogenmethyltransferaseG.Srinivasan,T.K.Ferguson,C.M.James,B.Hao,W.Gong,J.Krzycki,andM.Chan

OhioStateUniversity,Columbus,Ohio117整理課件118整理課件甲胺甲基轉(zhuǎn)移酶119整理課件Proteinshavelongbeenknowntobecomposedofonly20buildingblocks,calledaminoacids.Butabout25yearsago,scientistsdiscoveredanadditional,21staminoacid,calledselenocysteine.Now,twogroupsofresearchersledbybiochemistMichaelChanandmicrobiologistJosephKrzycki,bothofTheOhioStateUniversityinColumbus,haveidentifiedthe22ndaminoacidinanenzyme,calledmethyltransferase,whichbreaksdownmethylamine(CH3NH2)inmethane(CH4)-producingmicrobescalledmethanogens,leadingtotheproductionofmethane.Thescientistscallthisnewaminoacidpyrrolysine.

120整理課件121整理課件吡咯賴氨酸：Pyl

122整理課件密碼子為UAG123整理課件吡咯賴氨酸在產(chǎn)甲烷菌的甲胺甲基轉(zhuǎn)移酶中發(fā)現(xiàn),是目前的第22種參與蛋白質(zhì)生物合成的氨基酸,與標(biāo)準氨基酸不同的是,它由終止密碼子UAG的有義編碼形成.與之對應(yīng)的在產(chǎn)甲烷菌中也含有特異的吡咯賴氨酰-tRNA合成酶(PylRS)和吡咯賴氨酸t(yī)RNA(tRNAPPy1).tRNAPy1具有不同于經(jīng)典tRNA的特殊結(jié)構(gòu).產(chǎn)甲烷菌通過直接途徑和間接途徑這兩種途徑生成吡咯賴氨酰-tRNAPy1(Pyl-tRNAPy1),它還可能通過mRNA上的特殊結(jié)構(gòu)以及其他還未發(fā)現(xiàn)的機制,控制UAG編碼成為終止密碼子或者吡咯賴氨酸。124整理課件相關(guān)基因pylT：編碼了一特殊的tRNACUA。

pylS：編碼一種合成酶(LysRS)，能將賴氨酸結(jié)合到

tRNACUA上形成賴氨酸氨酰-tRNACUA。

pylB和pylC：賴氨酸氨酰-tRNACUA被修飾為吡咯賴

氨酸氨酰-tRNACUA。翻譯時吡咯賴氨酸氨酰-tRNACUA攜帶的吡咯賴氨酸被結(jié)合到蛋白質(zhì)鏈。過程中并沒有顯示本應(yīng)出現(xiàn)的終止翻譯的〔UAG〕作用。

125整理課件1.Hao,B.,W.Gong,T.Ferguson,C.James,J.Krzycki,andM.Chan.“ANewUAG-EncodedResidueintheStructureofaMethanogenMethyltransferase〞,Science,2002,296,1462-1466.2.Srinivasan,G.,C.James,andJ.Krzycki“PyrrolysineEncodedbyUAGinArchaea:ChargingofaUAG-DecodingSpecializedtRNA〞,Science,2002,1459-1462.126整理課件還可不可能產(chǎn)生

新的蛋白質(zhì)氨基酸？127整理課件需要哪些條件？128整理課件氨酰－tRNA合成酶,Mg2+AA+tRNA+ATP======氨酰-tRNA+AMP+PPi129整理課件tRNAGlnGln-tRNAsynthetaseAminoacidarmAnticodonarmATPCrystalstructureofGln-tRNAsynthetasecomplexedwithitscognatetRNA130整理課件131整理課件132整理課件會產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)氨基酸嗎？對細胞或生物有哪些影響？133整理課件有哪些用途？美國斯克里普斯研究所和加利福尼亞伯克利分校的研究小組通過改變大腸桿菌的基因，使大腸桿菌能夠產(chǎn)生一種叫做“對氨苯丙氨酸〞的新型氨基酸。134整理課件〔三〕真核生物蛋白質(zhì)的定向輸送135整理課件運往線粒體中的蛋白質(zhì)136整理課件〔四〕蛋白質(zhì)降解的調(diào)節(jié)：

泛肽－蛋白酶系統(tǒng)細胞周期蛋白的消失137整理課件ProteinsdiffermarkedlyintheirhalflivesandaretargetedfordestructionDamagedproteinsareusuallyquicklyremovedbycontrolleddegradation;Enzymesimportantinmetabolicregulationusuallyhaveshortlives;ProteinsaredegradedbyATP-dependentcytosolicsystemsinallcells;Ubiquitin,aextremelywellconserved76-residueprotein,tagsproteinsfordestructionineukaryoticcellsbytheactionofthreeenzymes(E1,E2andE3);138整理課件

2004年諾貝爾化學(xué)獎得主139整理課件140整理課件1.哺乳動物泛肽的結(jié)構(gòu)與特征MQIVFKTLTGKTITLEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVIRLRGG141整理課件2.泛素－蛋白酶作用過程

142整理課件143整理課件144整理課件1)在ATP存在下，泛素活化酶(ubiquitin-activatingenzyme)E1催化泛素羧基末端腺苷酸化，然后這個活化的泛素以羧基端的甘氨酸(G)與E1上的一個半胱氨酸之間形成硫酯鍵，這是一個高能鍵。2)在E1和泛素偶聯(lián)酶(ubiquitin-confugatingenzyme)EZS家族之一的催化下，將泛素仍以硫酯鍵連接于E2上，接著，在E2和泛素－蛋白連接酶(ubiquitin-proteinligase)E3的催化下，泛素從E2轉(zhuǎn)移到降解的蛋白質(zhì)的賴氨酸上形成酰胺鍵。這種泛素與蛋白質(zhì)的復(fù)合物是一個蛋白酶復(fù)合體的作用目標(biāo)，這個蛋白酶復(fù)合體由多條肽鏈組成，降解泛素－蛋白酶復(fù)合物為多肽，降解過程可能需要ATP供能，最后由泛素水解酶水解時放出游離的泛素再參加下一次循環(huán)。145整理課件146整理課件147整理課件148整理課件第二節(jié)

酶的活性調(diào)節(jié)

一、變構(gòu)效應(yīng)的調(diào)節(jié)〔一〕變構(gòu)酶的特性與結(jié)構(gòu)變構(gòu)酶特點：a.有多個亞基b.有四級結(jié)構(gòu)c.除了有可以與底物結(jié)合的活性中心外，還有可以結(jié)合調(diào)節(jié)物的別構(gòu)中心d.酶促反響動力學(xué)不遵循米氏方程149整理課件〔三〕變構(gòu)酶調(diào)節(jié)催化活性的機理(略)

〔四〕變構(gòu)酶舉例：

a.大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶－ATCase.6個調(diào)節(jié)亞基R，上面有結(jié)合ATP和CTP部位；6個催化亞基C，具催化活性。ATP激活劑，CTP抑制劑。150整理課件151整理課件152整理課件Catalytictrimersaregreen.

Regulatorydimersarered.153整理課件154整理課件〔二〕變構(gòu)酶的酶促反響動力學(xué)根據(jù)結(jié)合調(diào)節(jié)物后構(gòu)象的變化對酶與底物結(jié)合的影響，分為正協(xié)調(diào)效應(yīng)與負協(xié)調(diào)效應(yīng)。a.非調(diào)節(jié)酶b.正協(xié)同別構(gòu)酶：在中等或較低底物濃度下，底物濃度發(fā)生較小的變化引起酶促反響速度有較大的變化，可以靈敏的調(diào)節(jié)酶促反響速度。c.負協(xié)同別構(gòu)酶：在很寬的底物濃度范圍內(nèi)，酶促反響速度變化不明顯，即對底物濃度變化不敏感。155整理課件156整理課件b.3－磷酸甘油醛脫氫酶：負協(xié)同效應(yīng)別構(gòu)酶代表

此酶具有四個亞基，可以和四個NAD＋結(jié)合，但結(jié)合常數(shù)不同。酶結(jié)合NAD＋后，發(fā)生構(gòu)象變化。NAD＋和酶結(jié)合的解離常數(shù)很小，因此雖然底物NAD＋濃度很低，也能順利地和酶結(jié)合。但是當(dāng)NAD＋濃度升高時，酶結(jié)合了兩個NAD＋之后，再結(jié)合第三、第四個NAD＋就不那么容易。也就是說這時候再要提高酶反響速度是較難的，需要濃度大大提高才行。在一定的底物濃度范圍內(nèi)，底物濃度變化缺乏以影響酶反響速度。這就是負協(xié)同別構(gòu)酶對底物濃度變化的不敏感性。157整理課件158整理課件D-glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase

(holoform)(E.C.1.2.1.12)complexedwithNAD(red)159整理課件3-磷酸甘油醛脫氫酶與NAD＋結(jié)合的解離常數(shù)(平衡透析測定)

解離常數(shù)(mol/L)蝦肌兔肌K1<5×10-9<10-10K2<5×10-9<10-9K36×10-73×10-7K41.3×10-62.6×10-6

160整理課件在有機體中有許多需要NAD＋的代謝途徑，NAD+參與許多的反響，其濃度波動大。糖酵解是生物體內(nèi)重要的代謝過程，速度要求相對穩(wěn)定，在供氧缺乏的情況下，它仍需以一定的速度穩(wěn)定的進行反響。因為3-磷酸甘油醛脫氫酶為此過程的負協(xié)同別構(gòu)酶，對底物NAD＋濃度變化不敏感，所以當(dāng)NAD＋濃度很低(缺氧情況下)，其它需要NAD＋的代謝反響都隨之減緩時，酵解過程仍然能以一定的速度順利的進行。由此可以看到負協(xié)同效應(yīng)別構(gòu)酶的重要生理功能。161整理課件162整理課件二、同功酶的調(diào)節(jié)〔一〕同功酶的定義及形成同功酶(isoenzyme)是能催化相同的化學(xué)反響，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)、理化作用不完全相同的一組酶。它們普遍存在于動植物和微生物中，至今已發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種之多，同功酶可存在于生物的同一種屬或同一個體的不同組織，甚至同一組織、同一細胞中。初級同功酶：酶蛋白由不同的基因編碼而產(chǎn)生。次級同功酶：由一個酶蛋白的基因在表達過程中經(jīng)過不同的加工和修飾所產(chǎn)生。163整理課件〔二〕意義：1.

生物不同部位的生理狀況2.

在發(fā)育過程中，適應(yīng)不同的發(fā)育階段3.

分枝代謝的調(diào)節(jié)164整理課件三、酶分子的共價修飾

在某種酶的催化下，某一基因(磷?；蛳佘挣；?以共價鍵與酶分子相連，使酶活性發(fā)生改變。主要指蛋白質(zhì)的磷酸化與脫磷酸化165整理課件蛋白質(zhì)的共價修飾

乙?；篘末端的

－氨基和賴氨酸的ε－氨基甲基化：

－氨基、ε－氨基：精氨酸的胍基以及C末端的

－羧基和側(cè)鏈羧基上磷酸化：絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的羥基上泛素化：

－氨基和ε－氨基上糖基化：N－糖苷鏈連接于天門冬酰胺的酰胺基上O－糖苷鍵：絲氨酸、蘇氨酸、羥賴氨酸、羥脯氨酸的羥基上S－糖苷鍵：半胱氨酸的巰基166整理課件167整理課件〔一〕概念及特性蛋白質(zhì)的磷酸化與脫磷酸化過程是生物體內(nèi)存在的一種普遍的調(diào)節(jié)方式，幾乎涉及所有的生理及病理過程，如糖代謝、光合作用、細胞的生長發(fā)育、基因表達、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、甚至細胞的病變，在細胞的信號傳遞過程中有著極其重要的作用。蛋白質(zhì)的磷酸化是指由蛋白激酶催化的把ATP或GTP的γ位的磷酸基團轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的過程，其逆反響由蛋白磷酸酶催化，稱為脫磷酸化。168整理課件特性：ATP在大多情況下是磷酸基團的供體。蛋白質(zhì)中被磷酸化的氨基酸殘基主要是Ser或Thr，有些蛋白激酶可磷酸化酪氨酸。被磷酸化的氨基酸殘基可以有多個。多數(shù)蛋白激酶表現(xiàn)出一定的底物特異性，但很少有絕對特異性。一種蛋白質(zhì)可作為幾種蛋白激酶的底物和一種蛋白激酶有多種底物的情況是很常見。但一般情況下各類蛋白激酶都有它們的適宜的底物。169整理課件170整理課件Glucose(red),AMP(darkblue,allostericactivator),pyridoxalphosphate(PLP,B6derivative,lightblue),andser14(yellow)Glycogenphosphorylase171整理課件172整理課件173整理課件174整理課件底物蛋白質(zhì)被磷酸化的氨基酸殘基附近的氨基酸組成和順序常常構(gòu)成被蛋白激酶識別的特殊區(qū)域。例如依賴cAMP的蛋白激酶(PKA)需要底物被磷酸化的絲氨酸或蘇酸殘基附近(N－端方向)由堿性氨基酸即Arg或Lys殘基，如－Arg-Arg-X-Ser/Thr-x這樣的順序，其中X可以是任何氨基酸殘基。在絲氨酸/蘇氨酸類型的蛋白激酶中，由第二信使調(diào)節(jié)的蛋白激酶都需要底物具有類似的結(jié)構(gòu)，而這類蛋白激酶中非信息依賴性的酪蛋白激酶那么需要底物被磷酸化的氨基酸殘基C端附近要有酸性氨基酸殘基，即具有類似－X-X-Ser/Thr-X-Glu-的結(jié)構(gòu)順序。酪氨酸型的蛋白激酶有時需要被磷酸化氨基酸殘基附近要有酸性氨基酸，但是不是所有這類蛋白激酶都需要這樣的底物結(jié)構(gòu)尚不清楚。175整理課件〔四〕蛋白質(zhì)磷酸化的意義

1．催化蛋白質(zhì)磷酸化的蛋白激酶的活性受胞內(nèi)信使cAMP，Ca2+，DG等的調(diào)控，也即其活性主要受胞外信號的間接調(diào)節(jié)，是細胞對外界的信號作出反響，所引起的細胞效應(yīng)，許多是持久的，如細胞的分裂分化等過程。176整理課件2．調(diào)節(jié)細胞內(nèi)已存在的酶的“活性酶量〞。與酶的重新合成與分解相比，這種方式是細胞對外界刺激作出迅速反響。肌肉中，糖原磷酸化酶糖元G-1-P糖元利用的第一步，也是糖元降解利用的主要調(diào)節(jié)機制。動物體內(nèi)，兩種狀態(tài)a.(四聚體，激活)b.(二聚體，失活)177整理課件3．對外界信號具有級聯(lián)放大作用。胰高血糖素升高血糖的機理。178整理課件179整理課件4．蛋白質(zhì)磷酸化與脫磷酸化幾乎涉及所有的生理過程，功能上具有多樣性。除了其主要功能之一調(diào)節(jié)酶的活性以外，從磷蛋白在胚胎發(fā)育中的營養(yǎng)作用到細胞的生長發(fā)育、分裂分化調(diào)控、基因表達甚至癌變，都有這一過程的參與。調(diào)節(jié)的對象，可以是酶類、功能蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、各種受體等。最近人們還發(fā)現(xiàn)一種非常有趣的現(xiàn)象，在某種情況下，具有一定生理功能的某些蛋白質(zhì)可被磷酸化，但磷酸化的結(jié)果對其功能并沒什么明顯影響，這種情況被稱為“啞態(tài)〞磷酸化，后來發(fā)現(xiàn)，這些被磷酸化的蛋白質(zhì)常常是蛋白水解酶的“靶子〞而被降解。因此磷酸化作用還可能參與活性分子的“滅活〞而作為某些生理過程的調(diào)節(jié)方式。180整理課件5．蛋白激酶的自身磷酸化

(autophosphorylation)幾乎所有的蛋白激酶都可以進行自身的磷酸化作用，即某種蛋白激酶可以利用它自身作為底物。這種作用可以發(fā)生在酶分子之間，兩個酶分子之間可以相互磷酸化；也可發(fā)生在分子的內(nèi)部，即一個酶分子的催化部位可磷酸化同一分子的其它部位。181整理課件最近幾年研究證明：自身磷酸化是蛋白激酶調(diào)節(jié)其活性的重要方式。例如，磷酸化酶激酶自身磷酸化后其根底活性增高；依賴cAMP的蛋白激酶(Ⅱ型)的自身磷酸化可以影響其調(diào)節(jié)亞基與cAMP的結(jié)合與解離；胰島素受體具有蛋白激酶的功能，自身被磷酸化后其活性不再依賴胰島素。雖然對于這些自身磷酸化所引起的蛋白激酶特性的變化的具體調(diào)節(jié)機制和生理功能在多數(shù)情況下還不很清楚，但無疑這一特性為蛋白激酶所參與眾多的生理過程提供了一種特殊而有效的自我調(diào)節(jié)方式。182整理課件蛋白質(zhì)組研究簡介基因組(Genome)：是指一個細胞或病毒所包含的全部基因。是基因組方案的工作對象。183整理課件一、蛋白質(zhì)組學(xué)的定義及研究內(nèi)容

蛋白質(zhì)組(Proteome)一詞最早由澳大利亞學(xué)者Wilkins等于1994年提出，指的是由一個基因組geneome或一個細胞、組織表達的所有protein。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是研究在特定時間或環(huán)境下某個細胞或某種組織的基因組表達的全部蛋白質(zhì)。184整理課件蛋白質(zhì)組學(xué)的真正含義在于:它不是按照傳統(tǒng)的方式孤立地研究某種蛋白質(zhì)分子的功能,而是應(yīng)用各種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究某種蛋白質(zhì)在復(fù)雜的細胞環(huán)境中的功能。蛋白質(zhì)組學(xué)旨在列出全部蛋白質(zhì)的細目,弄清每一個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能及蛋白質(zhì)群體內(nèi)的相互作用,比照在疾病和健康狀態(tài)下它們的表達水平的變化。185整理課件

與以往的經(jīng)典蛋白質(zhì)化學(xué)研究相比，蛋白質(zhì)組的研究對象不再是單一或少數(shù)蛋白質(zhì)，而是著眼于全面性和整體性，需要研究體系內(nèi)所有蛋白質(zhì)組分的物理、化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)與功能，最終獲得每個蛋白質(zhì)組分的性質(zhì)功能、表達變化及翻譯后加工的大規(guī)模信息。186整理課件蛋白質(zhì)組與基因組的關(guān)系

蛋白質(zhì)有自身特有的活動規(guī)律，如動態(tài)修飾、加工、轉(zhuǎn)運定位、結(jié)構(gòu)形成、代謝等，均無法從基因組水平上的研究獲知。蛋白質(zhì)構(gòu)象病更難于只靠DNA序列來解釋。187整理課件ＤＮＡ序列所提供的信息僅僅是一種靜止的資源，而細胞的生命活動是通過各種蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的一種動態(tài)過程。一個機體內(nèi)所有不同的細胞都共享同一基因組，然而同一個機體的不同細胞和不同組織卻有不同的蛋白質(zhì)組，而且機體在不同發(fā)育階段，直至最后消亡的全過程中蛋白質(zhì)組也在不斷變化。因而蛋白質(zhì)組要比基因組復(fù)雜得多。

188整理課件正如RajParekh所說的那樣：“在一個細胞里，基因組能告訴我們理論上有哪些蛋白質(zhì)會被表達，mRNA能告訴我們哪些蛋白質(zhì)可能被表達，而蛋白質(zhì)組卻告訴我們蛋白質(zhì)表達的時間、地點、種類和數(shù)量。〞189整理課件二、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容1.細胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)的表達模式及修飾〔表達蛋白質(zhì)組學(xué)〕；2.蛋白質(zhì)的序列和高級結(jié)構(gòu)〔結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)〕；3.蛋白質(zhì)的胞內(nèi)分布及移位〔細胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)；4.蛋白質(zhì)的功能模式〔功能蛋白質(zhì)組學(xué)〕：蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及其與其他分子的相互作用；190整理課件三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的程序191整理課件生物學(xué)問題的提出實驗?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計實驗組和對照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳別離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點的切取胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實驗的進一步驗證蛋白信息的初步獲得192整理課件

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的程序蛋白質(zhì)組研究的核心──用于別離的雙向電泳(2-DE)193整理課件+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10第一向：等電聚焦

194整理課件+–pH3pH7.5pH10–pH3pH7.5pH10chargesize第二向：SDS電泳

Proteinsmigratethroughthegelatarateproportionaltotheirsize.Smallestproteinstravelthefurthestdistance195整理課件196整理課件MoreDatawithNarrowRangeIEFpH3-10pH3-6pH5-8pH7-10IPG EffectiveStrip pHOverlappingLength Range GelArea24cm 3-10 56cm18cm3-1044cm17cm 3-10 40cm11cm 3-10 26cm7cm 3-10 16cm197整理課件198整理課件199整理課件蛋白質(zhì)組研究的開展以雙向電泳技術(shù)作為核心。雙向電泳原理簡明,第一向進行等電聚焦,蛋白質(zhì)沿pH梯度別離至各自的等電點,隨后,再沿垂直的方向進行分子量的別離.目前,隨著技術(shù)的飛速開展,已能別離出10000個斑點(spot)200整理課件蛋白質(zhì)組技術(shù)的支柱——鑒定技術(shù)(Identication)201整理課件202整理課件蛋白質(zhì)組技術(shù)的支柱——鑒定技術(shù)考馬斯亮藍染色和銀染2.微量測序3.質(zhì)譜技術(shù)203整理課件適用于質(zhì)譜的染色方法〔公司產(chǎn)品〕考馬斯亮蘭〔Bio-Safe?Coomassie?colloidal250stain〕銀染〔SilverStainPlus?stain〕熒光染色〔SYPRO?Rubyproteingelstain〕204整理課件

StainingTrayOptimizingStainingEfficiency

ShakingRackSolutionBox

LidwithMotorIdealshakingmotionforoptimalstainingefficiency(patentpending)205整理課件206整理課件207整理課件蛋白質(zhì)組技術(shù)的支柱——鑒定技術(shù)2.微量測序3.質(zhì)譜技術(shù)208整理課件2D電泳→

Mass及序列分析209整理課件蛋白質(zhì)組研究的依靠——計算機及數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫(database)

生物信息學(xué)210整理課件蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫是蛋白質(zhì)組研究水平的標(biāo)志和根底。瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大，種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。211整理課件212整理課件四、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的應(yīng)用

213整理課件

原核及簡單真核生物的蛋白質(zhì)組研究

流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究致病微生物的蛋白質(zhì)組研究釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究214整理課件流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)是第一個獲得基因組全序列的生物.瑞士的一個小組通過2-DPAGE研究了流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組分,在ｐＨ3-10的范圍內(nèi)鑒定了約300個蛋白質(zhì)組分,然后用有兩個尿素濃度的麥黃酮(tricine)膠別離了很難別離到的5-20ku范圍內(nèi)的蛋白質(zhì),還鑒定了其中的80種.另外用肝素親和層析將堿性蛋白質(zhì)富集后,在ｐＨ6-11的范圍內(nèi)又鑒定了102個蛋白質(zhì),其中許多是核酸結(jié)合蛋白尤其是核糖體蛋白.華盛頓大學(xué)的另一個小組將雙向電泳得到的流感嗜血桿菌303個蛋白質(zhì)斑點進行質(zhì)譜分析,確定了263個蛋白質(zhì),其中大局部是外膜蛋白,以及與能量代謝和大分子合成相關(guān)的蛋白質(zhì).另外發(fā)現(xiàn)了幾種不能在基因組中找到對應(yīng)序列的蛋白質(zhì).令人驚奇的是,大約22%的被鑒定了的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與預(yù)計不同的等電點與分子質(zhì)量,顯示它們可能經(jīng)過了翻譯后加工。215整理課件大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究大腸桿菌全部4000多個基因的ＤＮＡ序列已被測定,人們想到如果把雙向電泳得到的蛋白質(zhì)譜與基因組分析結(jié)果聯(lián)合起來,就會得到更多有用的信息.基于此想法,建立蛋白質(zhì)基因聯(lián)合數(shù)據(jù)庫,希望籍此來答復(fù)以下幾方面的問題:ａ所有編碼基因的產(chǎn)物在雙向圖譜上的位置,ｂ各種蛋白質(zhì)的豐度,ｃ不同條件下各種蛋白質(zhì)表達水平及合成速率的變化,ｄ各種蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的定位,ｅ某些蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式及水平.目前,大腸桿菌的聯(lián)合數(shù)據(jù)庫已更新到第六版,大約包括1600個蛋白質(zhì)斑點的數(shù)據(jù),其中大約400個蛋白質(zhì)斑點已與大約350個基因相對應(yīng)(有些基因可能有多個蛋白質(zhì)產(chǎn)物),對于這些蛋白質(zhì),這個數(shù)據(jù)庫可以提供基因名稱、蛋白質(zhì)名稱、EC編號、功能范疇、Swiss-prot數(shù)據(jù)庫編號、Ｇenbank序列號、基因圖譜的位置、染色體上的轉(zhuǎn)錄方向以及一些生理信息(如在不同生長條件下該蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的豐度).216整理課件致病微生物的蛋白質(zhì)組研究蛋白質(zhì)組的一個重要應(yīng)用是在說明新抗生素作用機理的研究上.當(dāng)今,細菌對大多數(shù)抗生素都有了抗性,尋找作用于細菌內(nèi)新的靶子的研究工作已經(jīng)展開,找到了許多有效的抗菌化合物.但目前遇到的困難在于難以揭示新的化合物的作用靶子及其作用機理.有時雖在體外發(fā)現(xiàn)新化合物能夠使某種蛋白質(zhì)失活,但在體內(nèi)是否有這種現(xiàn)象和這是否是抗菌的主要機制仍然未知,現(xiàn)在雙向電泳分析提供了一個有效手段.例如在研究抑制核糖體類抗生素對細菌的作用機制時,對12種作用于翻譯過程的不同階段和核糖體內(nèi)不同分子的抗生素加以考察,發(fā)現(xiàn)其中8種誘導(dǎo)冷休克反響的一系列蛋白質(zhì),另4種誘導(dǎo)一系列熱休克反響的蛋白質(zhì),因此預(yù)計新的作用于核糖體的化合物也是誘導(dǎo)這兩種反響,并且籍此可以推測大腸桿菌對冷熱的反響發(fā)生于核糖體水平上.蛋白質(zhì)組研究的重要優(yōu)勢在于能夠從整體水平上分析不同條件下蛋白質(zhì)譜的變化.例如作為一種差異顯示技術(shù),這一技術(shù)已被用于比較結(jié)核分枝桿菌與牛結(jié)核分枝桿菌蛋白的不同,結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些在基因水平上很類似的蛋白在蛋白質(zhì)水平上有很大差異,這可能