Part1、磁珠分選的細(xì)胞治療中重要性

盡管近兩年細(xì)胞治療產(chǎn)品的細(xì)胞來(lái)源和種類不斷豐富，針對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行改造的細(xì)胞療法目前仍占據(jù)整個(gè)細(xì)胞治療行業(yè)的重要部分。而CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的制備流程十分復(fù)雜，涉及到單采采集，T細(xì)胞細(xì)胞分選激活，基因修飾，擴(kuò)增培養(yǎng)，收獲凍存等多個(gè)步驟。其中T細(xì)胞的分選和激活是非常關(guān)鍵的一個(gè)工藝環(huán)節(jié)，關(guān)系著后續(xù)是否成功制備細(xì)胞產(chǎn)品?！?/p>

圖1CAR-T細(xì)胞療法生產(chǎn)工藝流程概覽（圖片來(lái)源：諾華官網(wǎng)）越來(lái)越多的文獻(xiàn)表明，T細(xì)胞分選在CAR-T細(xì)胞制備中非常重要，直接影響到CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性。Juno的早期創(chuàng)始人StanleyR.Riddell曾發(fā)表報(bào)道：CD19CAR–TcellsofdefinedCD4+:CD8+compositioninadultBcellALLpatients（ClinicalT#NCT01865617）。文章主要介紹了限定比例的CD19-CART細(xì)胞在29例難治/復(fù)發(fā)急性B淋巴細(xì)胞白血病患者中的臨床治療效果，其中27例（93%）患者實(shí)現(xiàn)了骨髓水平的緩解。他指出：“與來(lái)自未分選的T細(xì)胞相比，有特定亞群的T細(xì)胞產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品具有更好的抗腫瘤效應(yīng)。“在2017年CDE發(fā)布的《嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞（CAR-T）制劑制備質(zhì)量管理規(guī)范》中也明確建議：”對(duì)采集的外周血進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞的分離及T細(xì)胞的分化，并對(duì)所分選出的T細(xì)胞進(jìn)行刺激和活化?！边M(jìn)行T細(xì)胞分選可以帶來(lái)如下好處：Part2、T細(xì)胞主要分選策略及產(chǎn)品目前針對(duì)T細(xì)胞的分選及激活主要有2種策略。一是以納米級(jí)別磁珠為基礎(chǔ)的分選，主要策略包括有CD4/CD8的分選或CD3的分選，聯(lián)合后續(xù)納米級(jí)別的CD3/CD28抗體激活試劑；二是以微米級(jí)別磁珠直接偶聯(lián)CD3/CD28抗體對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行分選及激活。市場(chǎng)上納米級(jí)別磁珠的大小在50-500nm之間，分為有柱式分選和無(wú)柱式分選。無(wú)柱式分選操作簡(jiǎn)單快捷，無(wú)需負(fù)擔(dān)分選柱的耗材成本。無(wú)柱式分選的納米級(jí)別磁珠大小在200-500nm，由于納米級(jí)別磁珠的磁力作用相對(duì)較弱，需要添加大量的磁珠抗體與細(xì)胞表面抗原結(jié)合，細(xì)胞才能被磁鐵吸附從而被分選出來(lái)。而過量的磁珠抗體標(biāo)記可能對(duì)細(xì)胞的信號(hào)通路產(chǎn)生激活從而影響細(xì)胞功能，因此無(wú)柱式分選往往應(yīng)用于陰性分選，即磁珠標(biāo)記非目的細(xì)胞，通過磁分的方式將非目的細(xì)胞去除。另一方面，無(wú)柱式分選操作中存在開放操作步驟，如需應(yīng)用到GMP生產(chǎn)，需要在A級(jí)環(huán)境進(jìn)行操作。而有柱式分選，可通過分選柱結(jié)構(gòu)有效增大磁場(chǎng)強(qiáng)度梯度，磁珠大小在50-100nm之間，少量的磁珠標(biāo)記，細(xì)胞就可被分選出來(lái)，且無(wú)需對(duì)磁珠進(jìn)行去除。借助于分選柱的密閉結(jié)構(gòu)，可將整個(gè)磁珠分選的步驟在全密閉的自動(dòng)化系統(tǒng)中完成，這也是目前CGT行業(yè)進(jìn)行細(xì)胞分選的金標(biāo)準(zhǔn)之一。以CliniMACSPlus為代表的臨床級(jí)別自動(dòng)化磁分設(shè)備廣泛應(yīng)用于細(xì)胞治療領(lǐng)域。▲

圖2有柱式與無(wú)柱式分選示意圖▲

圖3CliniMACSPlus細(xì)胞分選儀T細(xì)胞的另一種激活分選策略則采用微米級(jí)別磁珠直接偶聯(lián)CD3/CD28抗體。以Dynabeads?為代表的4.5μm級(jí)別的激活磁珠也是目前T細(xì)胞激活的另一主流產(chǎn)品。微米級(jí)別磁珠具有更強(qiáng)的結(jié)合能力，更強(qiáng)的激活效果，可將T細(xì)胞的分選及激活步驟整合。且微米級(jí)別磁珠無(wú)需分選柱結(jié)構(gòu)即可完成分選，節(jié)省了分選柱的耗材成本。但監(jiān)管法規(guī)要求對(duì)微米級(jí)別磁珠在最終產(chǎn)品的殘留進(jìn)行檢測(cè)，并達(dá)到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，因此需要對(duì)激活擴(kuò)增后的細(xì)胞進(jìn)行磁珠去除的操作。CTS?DynaMag?Magnet磁力架可對(duì)Dynabeads?結(jié)合的細(xì)胞進(jìn)行分選，并對(duì)培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行磁珠去除。整個(gè)操作流程可在全密閉的管路及袋子中完成，但需要手動(dòng)調(diào)整磁鐵的角度，控制液流速度，從而達(dá)到最佳的分選或去除效果。▲

圖4CTS?DynaMag?MagnetPart3、工藝放大及商業(yè)化的挑戰(zhàn)我國(guó)的細(xì)胞治療研發(fā)水平現(xiàn)在與國(guó)際處在同一水平線，CDE不斷頒布新的法規(guī)及指導(dǎo)原則，對(duì)細(xì)胞治療工藝的規(guī)范化也提出了越來(lái)越高的要求。除了全封閉工藝流程外，細(xì)胞治療產(chǎn)品的商業(yè)化工藝開發(fā)，急需自動(dòng)化，生產(chǎn)流程可追溯性的設(shè)備。特別是隨著國(guó)際形式的不斷變化以及疫情影響，進(jìn)口設(shè)備及試劑耗材存在到貨周期長(zhǎng)，甚至斷貨的情況，且價(jià)格昂貴，對(duì)國(guó)內(nèi)的細(xì)胞治療行業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了阻力。因此越來(lái)越多的細(xì)胞治療客戶在尋找國(guó)產(chǎn)化的替代方