（一）項(xiàng)目的意義、必要性和根據(jù)近年來(lái)大量的研究證明間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是骨髓微環(huán)境細(xì)胞的來(lái)源細(xì)胞，是來(lái)源于發(fā)育早期中胚層和外胚層的一類多能干細(xì)胞。MSCs因其含有下列特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注：(1)多向分化潛能：在體內(nèi)/外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多個(gè)組織細(xì)胞；(2)造血支持和促植入：作為造血微環(huán)境重要細(xì)胞成分——基質(zhì)細(xì)胞系的干細(xì)胞，MSCs通過(guò)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的直接作用、分泌細(xì)胞外基質(zhì)及多個(gè)細(xì)胞因子，實(shí)現(xiàn)對(duì)造血的精細(xì)調(diào)控，支持造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)，與造血干細(xì)胞共同移植可增進(jìn)造血干細(xì)胞的植入；(3)免疫調(diào)控：MSCs體現(xiàn)MHC-I類分子，不體現(xiàn)CD80，CD86，HLA-DR等協(xié)同刺激分子，體外可克制混合淋巴細(xì)胞反映，體內(nèi)誘導(dǎo)免疫耐受，對(duì)于防止和治療異基因造血細(xì)胞移植后引發(fā)的移植物抗宿主病，誘導(dǎo)器官移植免疫耐受有較好的應(yīng)用前景。(4)自我復(fù)制：MSCs作為干細(xì)胞能夠自我復(fù)制，體外擴(kuò)增、增殖能力強(qiáng)，能夠作為基因操作的干細(xì)胞平臺(tái)，在基因治療中有著十分誘人的前景。在造血干細(xì)胞移植治療惡性血液病的應(yīng)用研究增進(jìn)造血干細(xì)胞移植的造血重建：近年來(lái)有關(guān)MSCs體內(nèi)、外支持造血，克制免疫功效的報(bào)道有諸多，提示MSCs能夠作為造血干細(xì)胞移植的共移植手段以及應(yīng)用于臨床有關(guān)疾病的治療，可提高造血干細(xì)胞移植患者的存活率和移植后生存質(zhì)量，從而大大提高移植治療的有效性和適應(yīng)癥，含有良好的應(yīng)用前景。MSCs經(jīng)靜脈回輸后廣泛分布于骨髓、肝臟、脾、胃腸道、腎臟、肺臟及肌肉等器官組織，對(duì)受體BM-MSCs來(lái)源的檢測(cè)成果發(fā)現(xiàn)，供體來(lái)源的MSCs能夠定植于受體骨髓。Maitra等體外擴(kuò)增人MSCs，與造血干細(xì)胞（HSC）共移植給NOD/SCID小鼠，對(duì)照研究成果顯示，當(dāng)HSC數(shù)量有限時(shí)，只有同時(shí)予以MSCs輸注才干獲得更為有效的造血植入。黃紹良等進(jìn)行了自體和異基因MSCs聯(lián)合臍血移植的I期臨床實(shí)驗(yàn)，成果顯示異基因MSCs聯(lián)合UD-UCBT含有明顯增進(jìn)造血恢復(fù)的作用。Lazarus等對(duì)MSCs自體輸注進(jìn)行了I期臨床實(shí)驗(yàn)，從23例造血系統(tǒng)腫瘤涉及急性髓細(xì)胞白血病(AML)、急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤緩和期患者中分別抽取骨髓10ml-15ml，體外培養(yǎng)擴(kuò)增MSCs，15例患者經(jīng)2-3次傳代后給與3個(gè)劑量組進(jìn)行回輸，各劑量組均未發(fā)生輸注有關(guān)毒性反映。Koc等對(duì)28例晚期乳腺癌患者施行高劑量清髓性化療，然后輸注外周血?jiǎng)訂T的自體干細(xì)胞和經(jīng)體外擴(kuò)增的自體MSCs；全部患者也均未發(fā)生輸注有關(guān)反映，并且造血功效快速恢復(fù)。Lee等聯(lián)合應(yīng)用HLA半相合的親緣外周血?jiǎng)訂T干細(xì)胞及其體外擴(kuò)增的MSCs移植對(duì)1例高危AML女性患者進(jìn)行治療后,該患者造血功效快速恢復(fù),急、慢性GVHD均未發(fā)生，隨訪至移植后31個(gè)月時(shí)仍保持完全緩和。聯(lián)合HSCs和間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行移植確實(shí)能夠增進(jìn)移植后造血功效的恢復(fù)，其移植成功率明顯高于單純的HSCT。間充質(zhì)干細(xì)胞增進(jìn)HSCs歸巢、定植、增殖并不依賴于對(duì)骨髓造血微環(huán)境的修復(fù)，而與其產(chǎn)生的多個(gè)細(xì)胞因子如SDF一1、TGF一81、MIP一1a及MCP一1等有關(guān)。間充質(zhì)干細(xì)胞不僅能夠增進(jìn)造血功效恢復(fù)、減少移植后并發(fā)癥的發(fā)生率和死亡率，并且沒(méi)有明顯的毒副作用，提示間充質(zhì)干細(xì)胞移植是一種安全、可行的辦法。對(duì)移植物抗宿主?。℅VHD）的防治作用：同種異基因HSCs移植是可能治愈多個(gè)惡性血液病的唯一辦法，但是GVHD的發(fā)生卻大大減少了移植的成功率，GVHD是引發(fā)異基因HSCT后患者死亡的重要因素之一。研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞含有克制T細(xì)胞激活、增殖的功效，能夠用以GVHD的防治。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生GVHD時(shí)患者促炎因子分泌增加，樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞被激活引發(fā)組織損傷。體外實(shí)驗(yàn)表明MSCs能夠和多個(gè)免疫細(xì)胞互相作用，以變化其免疫功效。MSCs不僅含有免疫逃避能力，并且含有克制排斥反映的功效。MSCs能夠克制幼稚性和記憶性T淋巴細(xì)胞，阻抑T淋巴細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞(APCs)接觸，通過(guò)APCs間接的克制T淋巴細(xì)胞。盡管MSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功效的機(jī)制尚不清晰，但其對(duì)GVHD的防治潛能是能夠擬定的。MSCs含有良好的免疫耐受性，能夠逃避受者的免疫識(shí)別，對(duì)T淋巴細(xì)胞的克制作用和其供者來(lái)源沒(méi)有明顯的關(guān)系。近來(lái)Ringden等人應(yīng)用異基因間充質(zhì)干細(xì)胞治療類固醇耐藥的GVHD患者療效明顯。8例病人中有6例急性GVHD完全明顯，并且沒(méi)有MSCs治療的急性副反映出現(xiàn)。他們得出結(jié)論認(rèn)為對(duì)于異基因MSCs治療GVHD來(lái)說(shuō)，無(wú)論是HLA配型相合，半相合還是完全HLA不匹配供者來(lái)源的MSCs都合用，并且能夠較好的修復(fù)GVHD所致的腸道上皮損傷。因此能夠選用MHC不相匹配的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行移植以提高移植效率，克制GVHD?？傊?，聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞和HSCs進(jìn)行移植能夠提高移植效率，減少GVHD的發(fā)生率，并且是一種安全、無(wú)直接和后期毒性的治療辦法。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用研究干細(xì)胞含有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能是神經(jīng)科學(xué)研究的重要進(jìn)展，給許多以前認(rèn)為是不治之癥的神經(jīng)損傷性疾病(如脊髓損傷、腦損傷、外周神經(jīng)損傷等)的治療帶來(lái)了新但愿。在脊髓損傷中的研究：脊髓損傷后形成瘢痕組織妨礙神經(jīng)元的再生下行、神經(jīng)纖維的變性壞死以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)克制神經(jīng)元再生的微環(huán)境等因素，妨礙了脊髓損傷的恢復(fù)。骨髓MSCs的發(fā)現(xiàn)、分離與成功誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，為脊髓損傷的移植治療提供了“種子細(xì)胞”，其移植可能成為一種保護(hù)和增進(jìn)損傷的脊髓功效恢復(fù)的嶄新治療手段。Ankeny等將MSCs種植脊髓損傷的大鼠模型中，成果發(fā)現(xiàn)，移植組大鼠后腿空中蹬腿動(dòng)作以及步態(tài)循環(huán)控制能力恢復(fù)，MSCs移植物充滿病變腔隙，并隨著有宿主組織和白質(zhì)(髓鞘)的保存，證明含有神經(jīng)保護(hù)作用；與對(duì)照組相比，移植組能更有效地增進(jìn)軸索生長(zhǎng)；另外，MSCs中的大部分神經(jīng)纖維生長(zhǎng)方向與脊髓的長(zhǎng)軸索平行，提示其可直接縱向生長(zhǎng)。Hofstetter等對(duì)動(dòng)物損傷的脊髓模型進(jìn)行MSCss脊髓內(nèi)移植，1周后動(dòng)物步態(tài)明顯改善，移植5周后發(fā)現(xiàn)移植區(qū)和瘢痕組織區(qū)之問(wèn)可見(jiàn)到新生神經(jīng)纖維束穿過(guò)。以上事實(shí)闡明，植入MSCs對(duì)脊髓損傷引發(fā)的運(yùn)動(dòng)功效障礙有明顯的療效。在腦缺血性疾病方面的研究：現(xiàn)在，許多研究發(fā)現(xiàn)將人骨髓MSCs移植給腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ停苡行p少梗死體積、減少神經(jīng)缺點(diǎn)評(píng)分，并能明顯改善神經(jīng)功效的恢復(fù)。給永久性大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠靜脈輸注人骨髓MSCs，發(fā)現(xiàn)MSCs能進(jìn)入損傷腦區(qū)，其數(shù)量隨時(shí)間增加。在大鼠皮質(zhì)腦缺血后1周把純化的人骨髓MSCs移植到損傷周邊皮質(zhì)區(qū)能明顯改善大鼠的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功效，組織學(xué)分析移植的MSCs體現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(GFAP)、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(GalC)和神經(jīng)元標(biāo)志物，闡明移植的MSCs能向神經(jīng)元前體細(xì)胞或神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。鼠缺血腦組織的提取物培養(yǎng)能增進(jìn)人MSCs產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和血管源性生長(zhǎng)因子，提示腦缺血后的微環(huán)境變化可能與MSCs的治療作用有關(guān)。另外，Chert等還通過(guò)靜脈給大腦中動(dòng)脈栓塞24h后的大鼠注射人MSCs，分析缺血邊沿帶的血管發(fā)生和宿主腦內(nèi)的VEGF及其受體水平，發(fā)現(xiàn)MSCs能增進(jìn)大鼠腦內(nèi)血管發(fā)生，可能與人MSCs增加了內(nèi)源性VEGF及其受體水平有關(guān)。Crigler等研究發(fā)現(xiàn)人MSCs移植后，其不同的細(xì)胞亞型體現(xiàn)不同的神經(jīng)細(xì)胞調(diào)控分子，對(duì)宿主神經(jīng)細(xì)胞的存活和神經(jīng)再生起到了一定的作用。在心血管性疾病方面的應(yīng)用研究據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年死于血管性疾病的人數(shù)高達(dá)300多萬(wàn)，已占我國(guó)每年總死亡人數(shù)的34%-40%。由于溶栓治療、介入治療和外科治療等辦法治療等辦法的開(kāi)展，死亡率有所下降。但現(xiàn)在的治療辦法并不能逆轉(zhuǎn)已有的心肌病變，特別是大面積心肌梗死后心肌細(xì)胞的大量喪失。因此移植外源性細(xì)胞有望成為恢復(fù)心肌功效的新的方略。MSCs含有向心肌細(xì)胞分化的潛能，研究表明自體MSCs動(dòng)員或冠脈種植對(duì)急性心肌梗死，慢性缺血及心臟移植排斥反映等都有明顯改善作用。將MSCs直接移植到小鼠心臟，移植的細(xì)胞可體現(xiàn)肌球蛋白重鏈，并向心肌細(xì)胞分化。Shake等采用犬LAD結(jié)扎60min的心肌梗死模型，分離自體MSCs，心肌梗死后2周將MSCs注射到心肌梗死區(qū)，發(fā)現(xiàn)在全部治療組動(dòng)物心肌中都有MSCs存活，在MSCs移植后2周開(kāi)始體現(xiàn)肌肉特異性蛋白，4周后心臟收縮功效明顯改善，提示MSCs有心肌再生作用。將MSCs直接注射到梗死區(qū)或經(jīng)靜脈注射后，在損傷區(qū)均能見(jiàn)到MSCs定位，分化為心肌細(xì)胞，且心功效得到明顯改善并能防止有害的重構(gòu)。細(xì)胞移植是一種新型的治療心臟疾病如心肌梗死和心衰的辦法，它的良好療效來(lái)源于移植細(xì)胞的活性分布、被動(dòng)性提高心臟的機(jī)械功效、誘導(dǎo)血管新生、尚有對(duì)心臟生物學(xué)方面的其它作用。但移植細(xì)胞的療效以及最佳移植部位及移植時(shí)機(jī)有待進(jìn)一步研究在骨組織工程中的應(yīng)用由疾病、創(chuàng)傷所致的骨、軟骨損傷為臨床上常見(jiàn)且難以解決的問(wèn)題，現(xiàn)在常規(guī)的治療辦法有自體或者異體、異種骨移植，但它們都存在一定的問(wèn)題和限制，難以完全滿足臨床需要。現(xiàn)在，以組織工程辦法進(jìn)行軟骨再生的報(bào)道諸多，諸如在皮下注射軟骨細(xì)胞形成小的軟骨結(jié)節(jié)；運(yùn)用軟骨膜片將培養(yǎng)分離的軟骨細(xì)胞固定在軟骨缺損部位使軟骨再生。因此，修復(fù)大面積軟骨缺損的生物載體應(yīng)是形狀可控制的三維支架構(gòu)造的體內(nèi)植入物，軟骨細(xì)胞在這種構(gòu)造中能增殖分化，并且形成含有正常軟骨成分(重要指糖胺聚糖和II型膠原)以及含有對(duì)應(yīng)的生物機(jī)械特性的再生軟骨。骨髓MSCs含有強(qiáng)大的自我擴(kuò)增、自我繁殖及多向分化的能力，它的易擴(kuò)增性能在很短的時(shí)間內(nèi)得到足夠的種子細(xì)胞，并且隨著細(xì)胞的擴(kuò)增，細(xì)胞的性狀和分化特性并不會(huì)變化和喪失。在特定的成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，MSCs在體內(nèi)外均可分化為軟骨細(xì)胞或構(gòu)建出軟骨組織；Shapiro等用放射自顯影辦法證明當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨損傷穿透軟骨下骨時(shí)，損傷周邊的軟骨細(xì)胞并不參加組織修復(fù)，修復(fù)組織重要來(lái)源于骨髓MSCs細(xì)胞。由于骨髓MSCs細(xì)胞獲得方便，MSCs的分離和純化技術(shù)已趨成熟，現(xiàn)在被認(rèn)為是軟骨組織工程最有發(fā)展?jié)摿Φ姆N子細(xì)胞。展望對(duì)MSCs進(jìn)行基因修飾以治療缺點(diǎn)性疾病是現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)。MSCs含有體外擴(kuò)增培養(yǎng)及自我更新的能力，轉(zhuǎn)入外源基因后不影響其特性，因此可成為基因治療抱負(fù)的靶細(xì)胞。因此，能夠?qū)SCs細(xì)胞治療和基因治療結(jié)合起來(lái)，通過(guò)改造的MSCs對(duì)基因缺點(diǎn)、基因突變所致的疾病進(jìn)行治療。即使運(yùn)用MSCs進(jìn)行基因治療的前景樂(lè)觀，但是在臨床應(yīng)用中仍有許多安全性問(wèn)題需要解決，如MSCs可能定植于腫瘤組織，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供適宜的微環(huán)境；外源基因轉(zhuǎn)染MSCs的效率低下；基因變異可能造成腫瘤的發(fā)生；病毒性載體的生物安全性及基因修飾MSCs在患者體內(nèi)功效的檢測(cè)等?，F(xiàn)在MSCs的重要來(lái)源為成人骨髓，但成人骨髓源MSCs細(xì)胞數(shù)量及增殖分化潛能隨年紀(jì)的增大而下降，病毒感染率較高，且供者M(jìn)SCs的采集須行骨髓穿刺術(shù)，抽取大量骨髓（約500毫升），因此來(lái)源受到限制。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs在人胎兒和生后多個(gè)組織廣泛存在，涉及骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝和臍血等。但是，胎兒的應(yīng)用又受到道德倫理和傳統(tǒng)觀念的限制。有關(guān)臍血MSCs的報(bào)道存在較多爭(zhēng)議，且臍血MSCs的分離會(huì)損失臍血中造血干祖細(xì)胞，影響臍血干細(xì)胞的凍存和使用。因此，尋找新的MSCs的來(lái)源成為現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。我單位率先在國(guó)際上分離并且初步鑒定證明了臍帶MSCs特點(diǎn)，支持造血功效以及其它某些功效。我們研究發(fā)現(xiàn)，臍帶MSCs擁有諸多骨髓MSCss的特點(diǎn)。在神經(jīng)誘導(dǎo)條件下臍帶MSCs比骨髓MSCs更易于向神經(jīng)分化。另外臍帶MSCs細(xì)胞因子譜除了體現(xiàn)骨髓MSCs有關(guān)細(xì)胞因子外還額外體現(xiàn)GM-CSF和G-CSF.這些研究成果提示臍帶MSCs的開(kāi)發(fā)和運(yùn)用品有非常廣闊的前景。在上述研究的基礎(chǔ)上始終進(jìn)行著后續(xù)研究，現(xiàn)在在促造血重建，免疫調(diào)節(jié)方面以及治療血管性疾病已經(jīng)獲得很大進(jìn)展，為其此后的臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)平臺(tái)。（二）研究開(kāi)發(fā)和產(chǎn)業(yè)內(nèi)容及總體目的研究開(kāi)發(fā)和產(chǎn)業(yè)內(nèi)容1．多個(gè)組織間充質(zhì)干細(xì)胞的分離，純化和培養(yǎng)，以及生物學(xué)特性研究現(xiàn)在MSCs的重要來(lái)源為成人骨髓，但成人骨髓源MSCs細(xì)胞數(shù)量及增殖分化潛能隨年紀(jì)的增大而下降，因此來(lái)源受到限制。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs在人胎兒和生后多個(gè)組織廣泛存在，涉及骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝和臍血等，因此，尋找新的MSCs的來(lái)源成為現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。（1）骨髓、胎盤及臍帶MSCs的制備：應(yīng)用膠原酶和胰酶相結(jié)合的酶直接消化法，通過(guò)磁珠篩選，從胎盤和臍帶中獲得大量的MSCs。對(duì)比采用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)胎盤及臍帶MSCs，通過(guò)檢測(cè)MSCs的增殖和分化潛能的差別，建立MSCs的最適培養(yǎng)辦法。（2）骨髓、胎盤及臍帶MSCs的生物學(xué)特性、免疫調(diào)節(jié)、支持造血等功效研究：（3）骨髓、胎盤及臍帶MSCs多向誘分化；2．間充質(zhì)干細(xì)胞治療重大疾病的研究（1）治療惡性血液病作用的研究（2）治療血管性疾病作用的研究血管性疾病嚴(yán)重威脅著人類健康、影響患者生活質(zhì)量，尚缺少有效的治療方案。干細(xì)胞移植為這些血管病變和損傷的治療帶來(lái)了但愿，因此，充足運(yùn)用來(lái)源豐富、取材方便的間充質(zhì)干細(xì)胞的可塑性，開(kāi)展對(duì)血管性疾病防治新辦法的研究含有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義和社會(huì)意義。重要研究?jī)?nèi)容：=1\*GB3①建立內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量減少及功效缺損的動(dòng)物模型,檢測(cè)該模型動(dòng)脈的病理學(xué)形態(tài)及功效的變化，觀察與否有動(dòng)脈粥樣硬化的形成。篩選出增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量、提高其功效的因子及轉(zhuǎn)染后能提高內(nèi)皮祖細(xì)胞功效的基因。用這些因子解決內(nèi)皮祖細(xì)胞或基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，然后移植到實(shí)施內(nèi)膜球囊損傷術(shù)的兔體內(nèi)，觀察內(nèi)膜的修復(fù)狀況，明確提高內(nèi)皮祖細(xì)胞功效能否防治動(dòng)脈粥樣硬化的形成。=2\*GB3②間充質(zhì)干細(xì)胞局部移植治療肢體缺血性疾病：外周血管病變模型建立：糖尿病小鼠下肢微血管病變，結(jié)扎下肢動(dòng)脈致嚴(yán)重缺血。將MSC局部注射到病變下肢，然后通過(guò)下肢活動(dòng)能力受限評(píng)分以及下肢缺血評(píng)分來(lái)評(píng)定功效恢復(fù)。PBS做對(duì)照，骨髓來(lái)源的MSC為陽(yáng)性對(duì)照。運(yùn)用激光多普勒血流檢測(cè)局部血流恢復(fù)狀況，血管造影檢測(cè)局部側(cè)支循環(huán)的形成。=3\*GB3③間充質(zhì)干細(xì)胞作為基因治療的載體，轉(zhuǎn)染PDGF基因后其功效研究：通過(guò)PCR將目的基因PDGF擴(kuò)增，然后酶切，連接以及重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽(yáng)性克隆，重組腺病毒質(zhì)粒的純化，重組腺病毒的包裝、獲取、鑒定。重組腺病毒的擴(kuò)增與純化以及病毒梯度的測(cè)定。然后感染臍帶MSC，重復(fù)感染。含CMV啟動(dòng)子重組腺病毒感染效率的測(cè)定：運(yùn)用報(bào)告基因鑒定。PDGF轉(zhuǎn)染的臍帶MSC的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞增殖能力、抗凋亡能力、免疫表型與否變化及基因修飾過(guò)的MSC的多向分化能力有無(wú)變化。細(xì)胞的條件培養(yǎng)基收集后用Elisa辦法檢測(cè)分泌的因子PDFG、VEGF，bFGF等有無(wú)變化。=4\*GB3④轉(zhuǎn)染PDGF基因的臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞局部移植防治糖尿病微血管病變：鏈尿菌素誘導(dǎo)的裸鼠，在血糖尿糖增高后1－2個(gè)月，持續(xù)觀察其下肢毛細(xì)血管密度，小動(dòng)脈密度和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡狀況。局部移植PDGF修飾的MSC細(xì)胞，觀察肢體功效恢復(fù)狀況，下肢血流以及毛細(xì)血管密度等。觀察肌肉組織的PDGF等細(xì)胞因子的體現(xiàn)。同時(shí)研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞的凋亡狀況。（3）軟骨組織工程中間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床前應(yīng)用研究使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨,探索其體內(nèi)成軟骨的能力,并與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損成果做比較性研究,旨在為軟骨修復(fù)開(kāi)辟新的途徑。本實(shí)驗(yàn)用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞,用同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植作為陽(yáng)性對(duì)照組、缺損不解決作為陰性對(duì)照組,以糖胺聚糖和II型膠原或聚乳酸(PLA)為支架,移植修復(fù)兔全層關(guān)節(jié)軟骨缺損,通過(guò)對(duì)體內(nèi)修復(fù)組織及滑膜的檢測(cè),擬定臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)軟骨缺損的修復(fù)作用及免疫反映。重要研究?jī)?nèi)容:=1\*GB3①臍帶MSCs體外定向分化為軟骨細(xì)胞及鑒定選擇最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)因子和增殖因子、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間，研究臍帶MSCs向軟骨細(xì)胞分化的條件。=2\*GB3②臍帶MSCs和誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞與支架材料復(fù)合培養(yǎng)研究支架材料聚乳酸(PLA)對(duì)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖能力、粘附能力和免疫學(xué)功效等生物特性的研究。=3\*GB3③誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增進(jìn)全層關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究使用臍帶MSCs以及軟骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞，以糖胺聚糖和II型膠原或聚乳酸(PLA)為支架，移植修復(fù)兔全層關(guān)節(jié)軟骨缺損，通過(guò)對(duì)體內(nèi)修復(fù)組織及滑膜的檢測(cè)，并與兔骨髓MSCs修復(fù)軟骨缺損成果做比較，擬定臍帶MSCs以及軟骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞對(duì)軟骨缺損的修復(fù)作用及免疫反映。探索比較它們體內(nèi)修復(fù)軟骨的能力。（4）IL-27基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞治療本身免疫病的臨床前研究間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞治療和基因治療方面含有不可無(wú)視的優(yōu)勢(shì)，以間充質(zhì)干細(xì)胞為載體的基因治療將成為將來(lái)研究的熱點(diǎn)。IL-27是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的最重要的含有克制炎癥免疫作用的細(xì)胞因子?；陂g充質(zhì)干細(xì)胞和IL-27的抗炎作用在臨床上的廣泛應(yīng)用前景，我們將兩者結(jié)合起來(lái)：建立高體現(xiàn)IL-27的間充質(zhì)干細(xì)胞系，盼望其對(duì)本身免疫病提供新的治療方略。研究?jī)?nèi)容（1）高體現(xiàn)IL-27的MSC治療膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA）：建立小鼠的關(guān)節(jié)炎模型，將MSC或高體現(xiàn)IL-27的MSC注入關(guān)節(jié)炎部位或小鼠腹腔內(nèi)，觀察其治療作用。比較治療組和對(duì)照組小鼠關(guān)節(jié)病變處的病理變化，免疫細(xì)胞構(gòu)成，以及多個(gè)細(xì)胞因子的體現(xiàn)狀況。（2））高體現(xiàn)IL-27的MSC治療實(shí)驗(yàn)性本身免疫性腦脊髓炎（EAE）：建立小鼠的EAE模型，將MSC或高體現(xiàn)IL-27的MSC注入小鼠腦內(nèi)的病變部位，觀察小鼠的生存期。腦內(nèi)病變部位的細(xì)胞因子的體現(xiàn)，各免疫細(xì)胞所占的比例和功效狀態(tài)，腦部組織病理變化狀況。（3）高體現(xiàn)IL-27的MSC治療本身免疫性肝炎：建立本身免疫性肝炎模型。將MSC或高體現(xiàn)IL-27的MSC從尾靜脈注入小鼠體內(nèi)。觀察小鼠的生存期，腸子的病變狀況，病理變化，腸道和脾臟細(xì)胞因子的體現(xiàn)狀況和各免疫細(xì)胞亞型的構(gòu)成狀況。（4）高體現(xiàn)IL-27的MSC和造血干細(xì)胞共移植治療再生障礙性貧血：建立小鼠的再障模型，對(duì)其進(jìn)行allo-BMT的同時(shí)，尾靜脈輸注MSC或高體現(xiàn)IL-27的MSC。觀察對(duì)再障的治療效果，并觀察小鼠異基因骨髓移植(allo-BMT)后移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率和生存率的變化。流式細(xì)胞儀檢測(cè)受鼠各T細(xì)胞亞群的差別，檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌狀況和及骨髓的病理學(xué)變化。3．間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用中安全性研究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用，屬于同種異體的細(xì)胞移植，我們對(duì)培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行致瘤性、全身性毒性等方面進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。研究?jī)?nèi)容（1）體外致瘤實(shí)驗(yàn)：軟瓊脂培養(yǎng)法是體外檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞致瘤性最為慣用的辦法，與細(xì)胞的惡性程度有很大的符合率。普通腫瘤細(xì)胞在這樣的培養(yǎng)條件下1－3周可見(jiàn)克隆形成，在表層瓊脂內(nèi)成桑椹狀。用光學(xué)顯微鏡觀察，可見(jiàn)克隆內(nèi)的細(xì)胞呈圓形，透亮，排列成團(tuán)。普通認(rèn)為由16個(gè)細(xì)胞以上構(gòu)成的細(xì)胞團(tuán)為一種克隆，克隆內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而增多。如果細(xì)胞成顆粒狀，細(xì)胞輪廓不清晰，闡明細(xì)胞已經(jīng)死亡。如果持續(xù)培養(yǎng)2周仍未見(jiàn)克隆形成，則考慮接種的細(xì)胞沒(méi)有腫瘤細(xì)胞的特性，間接反映這種細(xì)胞的移植后無(wú)致瘤性。（2）體內(nèi)致瘤性實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞制劑接種到動(dòng)物體上，觀察其成瘤性，由于裸鼠含有下列特點(diǎn)：先天性胸腺缺點(diǎn)，胸腺依賴性免疫功效缺少，T細(xì)胞功效靠近于零，但B細(xì)胞功效大致正常，異種移植時(shí)無(wú)排斥反映。因此裸鼠普通作為接種的動(dòng)物。接種的辦法能夠是局部皮下接種或尾靜脈注射，接種后持續(xù)觀察1個(gè)月，根據(jù)肉眼觀察和病理切片觀察與否有腫瘤形成來(lái)反映檢測(cè)的細(xì)胞群體與否含有致瘤性。腫瘤細(xì)胞局部接種后約1個(gè)月左右（最短在3天）可見(jiàn)注射的局部有腫瘤出現(xiàn)，甚至有轉(zhuǎn)移瘤（普通在肺部）形成。經(jīng)病理組織學(xué)檢查能夠擬定腫瘤與否由接種的細(xì)胞產(chǎn)生。腫瘤細(xì)胞經(jīng)靜脈注射，在移植后1月左右可在不同的組織器官內(nèi)觀察到腫瘤形成。經(jīng)病理組織學(xué)檢查能夠擬定腫瘤與否由接種的細(xì)胞產(chǎn)生。（3）全身臟器急、慢性毒性實(shí)驗(yàn)研究，重要通過(guò)在NOD/SCID小鼠中注射相稱于臨床病人用量100倍的臍帶原始間充質(zhì)干細(xì)胞，在急性實(shí)驗(yàn)中持續(xù)觀察一周實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重，活動(dòng)，飲食，與否腹瀉，生存狀況。慢性毒性實(shí)驗(yàn)重要觀察細(xì)胞移植6個(gè)月后與否對(duì)造血，肝腎功效造成慢性損害，觀察指標(biāo)重要為血常規(guī)，生化指標(biāo)及處死后各重要臟器的病理學(xué)檢查，通過(guò)這些指標(biāo)綜合判斷間充質(zhì)干細(xì)胞與否存在嚴(yán)重的毒性作用?？傮w目的預(yù)期可獲得的成果、知識(shí)產(chǎn)權(quán)和人才培養(yǎng)狀況:建立起間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品、技術(shù)和資源平臺(tái)、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)，建立完整的生產(chǎn)和質(zhì)量控制體系；明確間充質(zhì)干細(xì)胞在治療血液系統(tǒng)惡性疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及軟骨組織工程中的作用以及機(jī)制；明確間充質(zhì)干細(xì)胞治療疾病的安全性；初步制訂上述幾個(gè)疾病的臨床實(shí)驗(yàn)方案，向國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局申請(qǐng)Ⅰ期臨床研究；申請(qǐng)專利項(xiàng)；發(fā)表SCI文章篇；臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞獲得SFDA或者衛(wèi)生行政主管部門對(duì)應(yīng)的臨床批文；培養(yǎng)博士后名，博士生名，碩士生名。（三）實(shí)施條件優(yōu)秀的學(xué)科帶頭人、成熟和完善的系列技術(shù)、國(guó)際水平先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室和配套設(shè)備為支撐：課題的承當(dāng)單位不僅含有學(xué)科優(yōu)勢(shì)，有一支年富力強(qiáng)的、構(gòu)造合理的優(yōu)秀研究隊(duì)伍，課題負(fù)責(zé)人在所屬領(lǐng)域的工作均獲得了國(guó)外同行的高度評(píng)價(jià)和承認(rèn)。并且在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞移植和基因治療的核心實(shí)驗(yàn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室及配套的儀器設(shè)備方面也有著明顯的優(yōu)勢(shì)，如在活細(xì)胞顯微分析、干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化和擴(kuò)增、細(xì)胞移植治療以及基因治療等技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)含有國(guó)際先進(jìn)水平的