烏梅白鳳丸有效成分對(duì)mpp誘導(dǎo)小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響

帕金森?。╬arkinson’sdisease，pd）是一種退行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，也是老年人常見的疾病。55歲以上的人發(fā)病率約1%。PD最主要病理特征是中腦黑質(zhì)致密帶(SNc)DA能神經(jīng)元進(jìn)行性變性、脫失及伴發(fā)的紋狀體軸突末梢DA耗竭,從而導(dǎo)致基底節(jié)神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的紊亂。PD的典型癥狀為靜止震顫、肌肉僵硬、運(yùn)動(dòng)遲緩及姿勢(shì)反射異常。目前由于PD的發(fā)病機(jī)制仍不清楚,遺傳、環(huán)境、自由基、興奮性氨基酸毒性作用、線粒體功能障礙等多種因素可能與PD的發(fā)生有關(guān),而細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致PD病人DA能神經(jīng)元死亡的重要原因之一。因此,抗細(xì)胞凋亡可能會(huì)起到保護(hù)DA能神經(jīng)元的作用。目前對(duì)于PD的治療方案多是對(duì)癥治療,30多年來左旋多巴一直是做為首選藥物,然而左旋多巴的長期應(yīng)用也有明顯的副作用,因此預(yù)防DA能神經(jīng)元變性從而延緩PD的發(fā)生可能會(huì)成為一種替代治療手段。烏雞白鳳丸有效成分(BFP)是一種廣泛用于治療婦科疾病的傳統(tǒng)中藥,并具有雌激素樣作用活性,如降低血壓、增加血管舒張度、減少血清三酰甘油、抗血小板活性以及刺激腦內(nèi)DA釋放等多種藥理作用,但目前其藥理方面的實(shí)驗(yàn)研究鮮有報(bào)道。本研究以C57BL小鼠為研究對(duì)象,用MPTP制備PD小鼠動(dòng)物模型,觀察BFP預(yù)處理對(duì)MPTP導(dǎo)致的黑質(zhì)DA能神經(jīng)元凋亡是否具有保護(hù)作用,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步探討。1材料和方法1.1酪氨酸羥化酶C57BL小鼠由北京維通利華動(dòng)物中心提供;BFP由香港中文大學(xué)生理系陳小章教授饋贈(zèng);酪氨酸羥化酶(TH)抗體、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)購自美國Sigma公司;TH免疫組化試劑盒、Bax抗血清、SABC試劑盒及DAB試劑盒由北京中山生物技術(shù)公司提供;高效液相色譜儀為美國Waters公司產(chǎn)品。1.2實(shí)驗(yàn)分組和治療10~11周齡C57BL小鼠36只,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2)g,于20~24℃室溫及相對(duì)濕度50%~60%晝夜循環(huán)光照條件下生活,自由飲水、取食,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境1周。隨機(jī)分為3組:①M(fèi)PTP組:每天9:00給予小鼠腹腔注射MPTP(30mg/kg),連用5d;②BFP+MPTP組:每天9:00小鼠口服喂食BFP(3g/kg),每天1次,連用14d,第15天給予小鼠口服喂食BFP(3g/kg),同時(shí)腹腔注射MPTP(30mg/kg),每天1次,持續(xù)到第19天;③正常對(duì)照組:口服喂食等體積生理鹽水。于每次注射藥物后均觀察小鼠行為變化。1.3th免疫組織化學(xué)染色1.3.1穿刺緩沖液制備用80g/L水合氯醛將小鼠麻醉后,行主動(dòng)脈插管,快速灌注150~200mL生理鹽水沖洗血液,隨即灌注300mL含40g/L多聚甲醛(4℃)的0.1mol/L磷酸緩沖液(PB),先快后慢。然后斷頭取腦,置于同一固定液中4℃固定6h,再置入含250g/L蔗糖的PB液內(nèi)4℃過夜或至腦組織塊沉入瓶底。1.3.2冷凍切片將腦組織塊于冠狀黑質(zhì)平面連續(xù)冷凍切片,片厚20μm。切片間隔分成2套,分別進(jìn)行TH免疫組織化學(xué)染色和Bax免疫組織化學(xué)染色。1.3.3出現(xiàn)多次心理壓力,加標(biāo)回復(fù)突變1例切片置入含體積分?jǐn)?shù)0.003H2O2的甲醛溶液中37℃孵育15min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,0.01mol/LPBS(pH7.4)沖洗,共3次,每次5min;行抗原修復(fù)后滴加體積分?jǐn)?shù)0.01的正常山羊血清,37℃孵育15min,吸去山羊血清,加一抗(1∶5000,用抗體稀釋液稀釋),于濕盒內(nèi)4℃過夜;PBS沖洗,滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液,37℃孵育30min,PBS沖洗;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液,37℃孵育30min,PBS沖洗,DAB顯色10~15min,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,最后鏡下觀察并照相。陽性細(xì)胞為細(xì)胞漿和突起著棕黃色。1.4bax免疫組織化學(xué)染色參照TH免疫組織化學(xué)染色方法,一抗為兔抗小鼠Bax(1∶200,用抗體稀釋液稀釋)多克隆抗體。陽性細(xì)胞為細(xì)胞漿著棕黃色。1.5視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)和計(jì)數(shù)取SNc最明顯處的3張切片,在密集陽性細(xì)胞中央部分取4個(gè)互不重疊的高倍視野(400倍),計(jì)數(shù)視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù),順序?yàn)樽陨隙?由左至右,不完全位于視野內(nèi)的細(xì)胞不計(jì)數(shù),最后把各視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)相加后再取平均數(shù)。1.6在圖案str中，da及其代謝產(chǎn)物二羥苯乙酸dopac和高香草酸hva的含量測(cè)定1.6.1流動(dòng)相倍比weDA、DOPAC、HVA的標(biāo)準(zhǔn)溶液最后用流動(dòng)相倍比稀釋得6個(gè)濃度梯度:每20μL含16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5ng。1.6.2小鼠腦組織病理學(xué)檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取正常對(duì)照組、MPTP組及BFP+MPTP組小鼠各6只,麻醉后斷頭取腦,于冰盒上分離并保留紋狀體組織,保存于-70℃冰箱備用。1.6.3冰浴靜置及b液制備將組織樣品轉(zhuǎn)入1.5mLEP管中,準(zhǔn)確稱量,加入冰冷的樣品預(yù)處理A液100μL,冰浴中超聲振動(dòng)10s,冰浴靜置1h后,4℃條件下,12000r/min離心20min,取80μL上清液轉(zhuǎn)入另一支EP管中,加入40μL冰冷的預(yù)處理B液,渦旋混勻,冰浴靜置1h,再于同一條件下離心20min,-70℃冷凍保存待測(cè)。1.6.4定性指標(biāo)的測(cè)定設(shè)定樣品流量1.0mL/min,ECD設(shè)定電壓0.65V,每一樣品檢測(cè)35min。各標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)樣,檢測(cè)其保留時(shí)間作為定性指標(biāo)。將各標(biāo)準(zhǔn)品混合并稀釋成6個(gè)濃度梯度,分別進(jìn)樣,檢測(cè)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得直線回歸方程。1.7統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。2結(jié)果2.1bfp和mptp對(duì)小鼠血清th免疫陽性細(xì)胞的影響MPTP組小鼠在MPTP注射后數(shù)分鐘可出現(xiàn)陣發(fā)性軀干震顫、豎毛、頻繁的竄蹦及爬桿不能等短暫的行為反應(yīng),隨后出現(xiàn)活動(dòng)減少,隨MPTP注射次數(shù)增加上述表現(xiàn)愈加嚴(yán)重,但次日略見恢復(fù)。給予BFP+MPTP組上述表現(xiàn)不明顯。MPTP組SNc的TH免疫陽性細(xì)胞數(shù)量為(8.03±0.09),較正常對(duì)照組(21.17±0.85)減少,而BFP+MPTP組的TH免疫陽性細(xì)胞數(shù)量(17.29±1.69)較MPTP組明顯增多。對(duì)染色結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析表明,MPTP組TH免疫陽性細(xì)胞數(shù)量較正常對(duì)照組明顯降低(F=228.73,q=29.44,P<0.01);BFP+MPTP組的TH免疫陽性細(xì)胞數(shù)量與MPTP組相比明顯升高(q=20.74,P<0.01)。2.2bfp和mptp對(duì)黑質(zhì)神經(jīng)元胞漿免疫陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果分析Bax在胞漿內(nèi)表達(dá),為棕黃色顆粒狀、絲狀或條狀物質(zhì)。正常對(duì)照組黑質(zhì)神經(jīng)元Bax表達(dá)較少,細(xì)胞漿染色較淺,陽性細(xì)胞數(shù)目較少,為(14.73±1.47)個(gè);MPTP組黑質(zhì)神經(jīng)元胞漿內(nèi)棕黃色顆粒狀、絲狀或條狀物質(zhì)較多、較深,染色細(xì)胞數(shù)目增多,為(32.40±2.67)個(gè);而BFP+MPTP組的染色細(xì)胞數(shù)目為(18.99±1.23)個(gè)。對(duì)染色結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析表明,MPTP組Bax免疫陽性細(xì)胞數(shù)量與正常對(duì)照組比較明顯升高(F=35.56,q=22.31,P<0.01);而BFP+MPTP組的Bax免疫陽性細(xì)胞數(shù)量與MPTP組比較顯著降低(q=16.93,P<0.01)。2.3差異顯著性fMPTP組Str內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA的含量降低,與正常對(duì)照組相比差異具有顯著性(F=18.85~128.29,q=8.67~22.46,P<0.01)。BFP+MPTP組Str內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA的含量比MPTP組升高,兩者差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.79~13.81,P<0.01)。見表1。3mptp對(duì)小鼠血清bax活性的影響PD是一種老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,主要病理改變是SNcDA能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失。在生化方面的改變,一般認(rèn)為是TH的缺失導(dǎo)致Str內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物含量的減低,從而引起一系列的癥狀。MPTP可引起SN-StrDA能神經(jīng)元的變性,線粒體能量耗竭和氧化應(yīng)激反應(yīng),是一種可用于誘導(dǎo)制備PD模型的神經(jīng)毒性物質(zhì),可導(dǎo)致靈長類和小鼠SN-Str通路的DA能神經(jīng)元變性,因此可模擬出PD的臨床和病理特征,用MPTP制備的小鼠模型是國內(nèi)外公認(rèn)的最好的PD動(dòng)物模型之一,已被廣泛用于該病發(fā)病機(jī)制和治療等研究。本研究給予C57BL小鼠皮下注射嗜神經(jīng)毒素MPTP(30mg/kg)連續(xù)5d制成PD小鼠模型,采用HPLC法檢測(cè)其Str內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA的含量,發(fā)現(xiàn)MPTP組Str內(nèi)DA及HVA含量明顯下降,運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色法可觀察到MPTP組SNcTH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目與正常對(duì)照組相比明顯減少,故可以判定此MPTP致小鼠PD模型造模成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示,經(jīng)BFP預(yù)處理后,SNcDA能神經(jīng)元脫失現(xiàn)象減少,凋亡細(xì)胞比例也明顯減少,提示BFP有抗MPTP誘致黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡的作用。Bax基因作為Bcl-2家族中調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程的代表基因之一,是近年來研究的熱點(diǎn)。有研究顯示,黑質(zhì)內(nèi)幾乎所有的神經(jīng)元,尤其是DA能神經(jīng)元內(nèi)含有大量的Bax蛋白,并在生長發(fā)育過程中調(diào)控著DA能神經(jīng)元凋亡的進(jìn)程。ZIV等用PC12細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2能明顯抑制DA氧化及其氧化產(chǎn)物的生成,并且能阻止細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)水平下降。另有研究顯示,Bcl-2過度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠可抵抗MPTP和6-0HDA對(duì)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損害。此外,Bcl-2還可以通過其他途徑,如影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流、阻止線粒體中細(xì)胞色素C的釋放等發(fā)揮抗凋亡作用,而Bax蛋白則是通過與Bcl-2相關(guān)蛋白形成二聚體的形式來發(fā)揮作用,故能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HASSOUNA等發(fā)現(xiàn)小鼠注射MPTP后,其腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)BaxmRNA合成增加,呈現(xiàn)相應(yīng)Bax免疫反應(yīng)性的神經(jīng)元都發(fā)生了死亡,說明MPTP毒性作用誘導(dǎo)Bax表達(dá),其病理學(xué)意義是促進(jìn)凋亡的發(fā)生。本文研究顯示,MPTP可誘導(dǎo)黑質(zhì)Bax蛋白表達(dá)水平增加,與以前研究結(jié)果相符;同時(shí),BFP+MPTP組的黑質(zhì)Bax蛋白表達(dá)降低,提示BFP阻斷MPTP誘導(dǎo)的黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡的可能的途徑之一是通過減少Bax表達(dá)來發(fā)揮其抗細(xì)胞凋亡作用的,從而證實(shí)了BFP有效成分的作用機(jī)制與抗凋亡有關(guān)。由于PD的發(fā)病是多種致病因素如遺傳、環(huán)境、年齡等共同作用的結(jié)果,其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。目前,PD的治療主要是DA的替代療法,即服用左旋多巴來彌補(bǔ)腦內(nèi)DA不足,以改善臨床癥狀,但這并不能阻止DA能神經(jīng)元的繼續(xù)凋亡,而且DA本身也可誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡,左旋多巴的這些副作用極大地限制了它的應(yīng)用。近幾年來,隨著對(duì)PD發(fā)病機(jī)制研究的快速發(fā)展以及對(duì)細(xì)胞凋亡研究的深入,在對(duì)PD病人的實(shí)驗(yàn)