植物體內(nèi)有效清除活性氧的酶類

環(huán)境條件可能會導致植物總水平碳和氮代謝變化，從而降低整體植物的光合和生長速度。然而在分子水平上,則由于活性氧的產(chǎn)生與活性氧清除系統(tǒng)之間的平衡被破壞,植物細胞中積累大量的活性氧,從而對許多重要的細胞組分造成氧化損傷。產(chǎn)生的活性氧包括:超氧根陰離子(O2·-)、氫氧根離子(OH-)、羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧(·O2)和過氧化物自由基(ROO·)。它們可以導致膜脂過氧化、堿基突變、DNA鏈的斷裂和蛋白質(zhì)的損傷植物體內(nèi)有效清除活性氧酶類包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化氫酶(CAT)等。SOD可以催化超氧化物生成H2O2和O2;APX和過氧化氫酶可將H2O2還原成H2O。利用基因工程增加這些酶類在植物細胞內(nèi)的含量,從而獲得具有實用價值的抗逆農(nóng)作物,是近幾年國內(nèi)外生物工作者研究的重點之一。目前,已從多種植物材料中分離克隆了SODcDNA并用來轉(zhuǎn)化不同的植物,均獲得抗逆程度不一的轉(zhuǎn)基因植株。1抗氧化酶系統(tǒng)的組成及序列SOD作為植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線,清除細胞中多余的超氧根陰離子。在高等植物中,SOD根據(jù)其輔基部位結(jié)合的不同金屬離子分為三類:Mn-SOD、Fe-SOD、Cu/Zn-SOD。不同種類的SOD對于不同抑制劑的敏感程度不同,并以此作為最初分類的生化依據(jù)。對SOD基因家族的深入研究是在玉米中進行的。已得到的序列分析表明,廣泛存在于真核生物中的Cu/Zn-SOD與Fe-SOD和Mn-SOD不同源?，F(xiàn)已從多種材料中分離純化出了Cu/Zn-SOD。該酶由兩個亞基組成,每個亞基各含有一個Cu、一個Zn。在植物中,Cu/Zn-SOD是三種超氧化物歧化酶中含量最豐富的一類,主要存在于葉綠體、胞質(zhì)和過氧化物酶體中。Mn-SOD和Fe-SOD每個亞基都只含一個金屬離子,Mn-SOD主要位于線粒體中,從Fe-SOD的一些生化指標及前導序列推測,該酶存在于葉綠體中。Mn-SOD與Fe-SOD具有序列相似性,并且含有完全相同的特征結(jié)構域,所以將存在于線粒體中的Mn-SOD導入煙草、苜蓿的葉綠體后,轉(zhuǎn)基因植株對臭氧及干旱脅迫的抗性增強,但將葉綠體Fe-SOD過量表達的植株與葉綠體Mn-SOD過量表達的植株同時用百草枯(Paraquat)處理時,前者比后者具有更強的抗氧化性。為了解釋這一實驗結(jié)果,VanCamp等(1996)提出了一個假說:一方面可能是由于這兩種蛋白分子本身的特性所決定;另一方面可能是由于它們在葉綠體中具有不同的亞細胞定位所造成。此外,通過對大腸桿菌K-12的研究發(fā)現(xiàn):Fe-SOD、Mn-SOD具有不同的抗氧化功能,Mn-SOD對DNA的保護更為有效,而Fe-SOD在菌體中則重點保護那些對氧化作用敏感的可溶性蛋白。2脅迫因子與sod基因轉(zhuǎn)錄水平對煙草、番茄、玉米的sod表達進行深入分析發(fā)現(xiàn):在不同的發(fā)育階段用不同的脅迫處理,該基因表達呈現(xiàn)出不同特征。例如:煙草胞質(zhì)Cu/Zn-SOD在熱激、低溫及百草枯處理后增加最為明顯;光照加百草枯處理可同時誘導番茄葉綠體Cu/Zn-SOD和胞質(zhì)Cu/Zn-SOD基因的表達;但干旱只能誘導細胞質(zhì)Cu/Zn-SOD基因的轉(zhuǎn)錄。總之,在脅迫條件下,SOD基因轉(zhuǎn)錄水平的大幅度提高與SOD酶活性的適度增加是相關的。脅迫因子很可能加速了SOD的代謝,迫使基因提高轉(zhuǎn)錄活性來維持正常水平的蛋白濃度。不同種類的脅迫因子是通過何種信號誘導特異sod表達的呢?一種假說認為:由于不同脅迫因子使各個亞細胞遭受不同程度的氧化脅迫,而不同的亞細胞器又存在種類特異的SOD作為抗氧化保護劑,所以氧化脅迫的程度不同則導致了各種sod表達的差異。雖然這個假說仍需進一步的實驗證明,但不同細胞器中存在的專一脂類過氧化物酶無疑是一個極好的佐證。Alscher(1989)發(fā)現(xiàn),當用臭氧、SO2熱激、干旱等脅迫因子處理植物時,植物體內(nèi)還原型谷胱甘肽的含量有所增加;Herouart(1993)的研究表明煙草sodCc表達受氧化還原的控制,谷胱甘肽既可以作為抗氧化劑直接發(fā)揮作用,也可激活抗逆基因如Cu/Zn-SOD基因的轉(zhuǎn)錄。另外,用H2O2處理煙草實生苗時發(fā)現(xiàn):胞質(zhì)中自由Ca2+濃度的增加與SOD酶活性降低呈現(xiàn)出一定的相關性,推測Ca2+參與了信號轉(zhuǎn)導。但尚不知道哪一種sod是受Ca2+的調(diào)控,參與清除ROS的其它酶類是否受上述處理的影響還有待進一步研究。3基因表達對基因表達的影響幾種SODcDNA已從植物中得到克隆并用來轉(zhuǎn)化不同的植物,最終獲得SOD活性增強的轉(zhuǎn)基因植株。在轉(zhuǎn)基因煙草、苜蓿、土豆和棉花中,葉綠體SOD的過量表達,提高了它們對氧化脅迫的耐受性;SOD在苜蓿線粒體和土豆細胞質(zhì)中的過量表達,也具有同樣的效果;轉(zhuǎn)基因苜蓿ChlSOD的過量表達,提高了植株對凍害的耐受性;轉(zhuǎn)基因煙草ChlSOD的過量表達,提高了植株對冷害的耐受性。酵母線粒體Mn-SOD在水稻葉綠體中的過量表達,提高了轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫的耐受性,而且鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株中SOD和APX的活性都較對照株提高1.5~2.0倍,CAT活性降低的程度小于對照株;擬南芥耐鹽突變株幼苗對MV的抗性較對照株提高了10倍,SOD和APX的活性分別比野生型提高1.3和3倍。然而轉(zhuǎn)基因煙草Fe-SOD的過量表達并未提高其對冷害和鹽脅迫的耐受性;用矮牽牛葉綠體Cu/Zn-SODcDNA轉(zhuǎn)化煙草得到的轉(zhuǎn)基因植株Cu/Zn-SOD活性提高了30~50倍,但植株并未提高對百草枯或臭氧引起的氧化損傷的耐受性;用同樣的基因表達框架轉(zhuǎn)化番茄,得到的轉(zhuǎn)基因植株也未提高對低溫和強光誘導的光抑制的耐受性。轉(zhuǎn)基因植株中存在的這些區(qū)別說明:1)SOD可能具有不同的抗氧化功能;2)轉(zhuǎn)基因植株中基因表達水平有所差異,SOD的表達只在一定范圍內(nèi)是有效的,超出這一范圍的過量表達往往是有害的;3)SOD與其它活性氧清除酶類,如抗壞血酸過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶之間的酶活性平衡可能是很關鍵的。在光培養(yǎng)中,只有過量表達ChlSOD的植株具有顯著的MV抗性,而在暗培養(yǎng)中,過量表達ChlSOD和MitSOD植株都有較高的MV抗性。目前研究表明:(1)強光下生長的植株較弱光下生長的植株具有較高的MV耐受性。(2)只有在強光下,葉綠體Mn-SOD的過量表達才能提高植株對MV的耐受性。這可能是因為SOD只是葉綠體抗氧化酶類中的一環(huán),只有當活性氧的清除能力不受其它抗氧化酶類及底物制約時,SOD的過量表達才能提高植株對氧化脅迫的耐受性。在光照條件下生長的轉(zhuǎn)基因植株能夠提高這些酶及底物的表達,從而增強了植株對MV的抗性。另外,實驗表明,在過量表達葉綠體Mn-SOD的植株中,其內(nèi)源SOD同工酶的活性都較非轉(zhuǎn)基因植株低。SenGupta等的實驗也證明豌豆葉綠體Cu/Zn-SOD在煙草中的過量表達,導致了轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源葉綠體Cu/Zn-SOD活性的降低。這些結(jié)果說明內(nèi)源SOD同工酶的表達是由超氧化物離子或超氧化物發(fā)生反應產(chǎn)生可動的信號分子誘導的。外源SOD基因的過量表達可以降低超氧化物或信號分子的濃度,從而導致內(nèi)源SOD基因表達的降低。4活性氧的產(chǎn)生及生物學意義綜上所述,由于植物中許多抗氧化劑參與活性氧的清除過程,而且在氧化脅迫下,許多細胞組分需要保護,所以單純地轉(zhuǎn)化某一個基因使之過量表達很難達到預期的效果。近幾