不同地區(qū)和作物上根結(jié)線蟲群體is片段的比較

根結(jié)線蟲是一種非常重要的植物致病性線蟲，廣泛分布于世界各地。在熱帶和亞熱帶雨量充沛、氣候溫和的地區(qū),根結(jié)線蟲的危害甚至比孢囊線蟲(Heterodera和Globodera)更為嚴(yán)重。迄今已知道的根結(jié)線蟲對(duì)植物造成危害的超過(guò)3000種,經(jīng)常使寄生的多種植物和經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物受到侵害,造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。同一類群的植物寄生線蟲種間具有很多相似的特征,種內(nèi)群體因生態(tài)條件的差異有明顯的生理分化現(xiàn)象,存在不同的生理小種或致病型,同一種線蟲因生理小種或致病型的差異對(duì)特定作物品種的危害程度差別很大。因而,采取可靠的分類鑒定方法是植物線蟲病害防治的基礎(chǔ)。自20世紀(jì)80年代中期以來(lái),利用分子生物學(xué)技術(shù)和方法直接檢測(cè)植物線蟲種間和種內(nèi)群體在遺傳組成上的根本差異,以揭示線蟲發(fā)育的進(jìn)化關(guān)系的研究也日趨增多。利用根結(jié)線蟲基因組DNA和線粒體DNA的AFLP指紋以及根結(jié)線蟲rDNA-ITS-PCR-RFLP分析可以對(duì)不同的根結(jié)線蟲進(jìn)行分類和鑒定。國(guó)外學(xué)者對(duì)奇特伍德根結(jié)線蟲(Meloidogynechitwoodi)和法拉克斯根結(jié)線蟲(M.fallax)的基因組DNA進(jìn)行AFLP分析后,發(fā)現(xiàn)奇特伍德根結(jié)線蟲和法拉克斯根結(jié)線蟲在種內(nèi)都存在遺傳多樣性,而且奇特伍德根結(jié)線蟲種內(nèi)的多樣性要高于法拉克斯根結(jié)線蟲。另外,有的國(guó)外學(xué)者用引物5S和引物18S擴(kuò)增爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)、花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)、南方根結(jié)線蟲(M.incognita)、瑪雅圭根結(jié)線蟲(M.mayaguensis)和北方根結(jié)線蟲(M.hapla)的rDNA中18S和5S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)域(internaltranscribedspaceregion,ITS),從爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和南方根結(jié)線蟲中擴(kuò)增出715bp的ITS產(chǎn)物,從瑪雅圭根結(jié)線蟲中擴(kuò)增出831bp的ITS產(chǎn)物,從北方根結(jié)線蟲中擴(kuò)增出的ITS最小,僅為564bp,從而有效地揭示了種內(nèi)和種間變異。還有的國(guó)外學(xué)者用通用引物5367、5368、F194和F195擴(kuò)增奇特伍德根結(jié)線蟲、法拉克斯根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、納西根結(jié)線蟲(M.naasi)群體的rDNA-ITS區(qū),均得到1條大小約760~800bp的片段,然后用17種限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物;用RFLP技術(shù)分析了不同種的多態(tài)性片段,并用RAPD技術(shù)構(gòu)建了這些種的遺傳距離圖,有效揭示了根結(jié)線蟲種間變異。彭德良等用PCR技術(shù)對(duì)來(lái)自中國(guó)的10個(gè)根結(jié)線蟲群體進(jìn)行rDNA-ITS-RFLP及其序列的研究,應(yīng)用通用引物F195和V5367擴(kuò)增出1條約700bp的DNA片段,并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和形態(tài)測(cè)量值將這些群體診斷為4個(gè)常見種和象耳豆根結(jié)線蟲(M.entrolodii)。廖金鈴等對(duì)廣東、海南和福建等地的根結(jié)線蟲rDNA的ITS區(qū)進(jìn)行了研究,通過(guò)對(duì)熒光AFLP片段分析和對(duì)18S基因組、ITS區(qū)和26S基因組的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序分析,成功鑒定出花生根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和描述的1個(gè)新種番禺根結(jié)線蟲(M.panyuensis)。趙鴻等2003年應(yīng)用3種限制性內(nèi)切酶酶切各地根結(jié)線蟲rDNA-ITS的擴(kuò)增產(chǎn)物,成功的區(qū)分出各地根結(jié)線蟲。RAPD技術(shù)也可以從整個(gè)基因組DNA篩選與某一性狀相連鎖的DNA標(biāo)記。由于RAPD容易檢測(cè)出DNA的多態(tài)性,通過(guò)RAPD可以鑒定植物線蟲的不同屬種及種下群體。RAPD分析已成功的用于4種常見根結(jié)線蟲:南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲的鑒定和鑒別。通過(guò)對(duì)不同類群線蟲及其種和種下群體的RAPD,獲得的多態(tài)性資料進(jìn)行分析,可以了解它們彼此DNA的同源程度,從而確定彼此的親緣關(guān)系和進(jìn)化地位。喻盛甫等用120個(gè)隨機(jī)引物對(duì)南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲等4種常見根結(jié)線蟲10個(gè)小種和類型的全基因組DNA進(jìn)行了RAPD分析,表明4種根結(jié)線蟲種及小種擴(kuò)增的譜型有明顯的特異性。筆者以rDNA-ITS作為根結(jié)線蟲1個(gè)遺傳標(biāo)記,通過(guò)PCR擴(kuò)增尋找根結(jié)線蟲該序列的特異性片段,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序分析不同根結(jié)線蟲在該序列的同源性和親緣關(guān)系,旨在為根結(jié)線蟲遺傳多樣性研究提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1試驗(yàn)昆蟲的來(lái)源供試根結(jié)線蟲均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所采集和保存,其編號(hào)和來(lái)源見表1。1.2蛋白酶變性試驗(yàn)從新鮮的植物根結(jié)組織中挑取單頭根結(jié)線蟲的雌蟲,放入盛有10μL滅菌重蒸水的PCR管中,并用解剖針將其刺破。加入8μL預(yù)冷的WLB(蠕蟲裂解液)和2μL蛋白酶K(1mg/mL),13200r/min離心0.5min。迅速放入-20℃冰箱中至少10min。然后分別在65℃下溫育1.5h以降解核糖核酸,95℃下10min,使多余的蛋白變性。最后在13200r/min下離心1min,吸取上層DNA清液于PCR管中,-20℃保存?zhèn)溆谩?.3pcr檢測(cè)根結(jié)線蟲總dna用Vrain設(shè)計(jì)的線蟲ITS擴(kuò)增的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,50μL反應(yīng)體系。10×PCRBuffer(Mg2+Plus)5μL,dNTPMixture4μL,Taq酶(5U/μL)0.4μL,引物26S(20μmol/L)1.5μL,引物V5367(20μmol/L)1.5μL,模板DNA5μL,加ddH2O至50μL。所用引物的序列如下:V5367:5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′(上游),26S:5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′(下游)。PCR擴(kuò)增以根結(jié)線蟲的總DNA為模板,反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,然后94℃1min,55℃1.5min,72℃2min,循環(huán)35次;最后72℃延伸10min。4℃保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠110V電泳30min進(jìn)行檢測(cè),用0.5×TAE作為電泳緩沖液,并在紫外燈下觀測(cè)照相。1.4pcr產(chǎn)品的恢復(fù)PCR產(chǎn)物采用TIANGEN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化,具體操作步驟參照試劑盒操作說(shuō)明。1.5發(fā)酵劑lidh5atg將純化后的PCR產(chǎn)物與PGEM-TEasyVector在4℃下連接12~16h,采用熱擊法轉(zhuǎn)化到通過(guò)CaCl2法制備的E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN公司)中。在含有Ampicillin(100mg/L),IPTG(24mg/L)和X-gal(200mg/L)的LB篩選平板上挑取單個(gè)白色菌落于含有Ampicillin(100mg/L)的液體LB中搖培過(guò)夜。采用TIANGEN公司的質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA,經(jīng)PCR鑒定后,篩選出含有正確插入片段的重組克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)序。1.6序列分析和同源性比較采用DNAMAN軟件對(duì)所測(cè)定的序列進(jìn)行比對(duì)分析,找出各不同地區(qū)根結(jié)線蟲ITS序列的同源性以及其親緣關(guān)系和遺傳距離。2結(jié)果與分析2.1海南胡椒上根結(jié)線蟲片段的大小根結(jié)線蟲的總DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后,除海南胡椒上根結(jié)線蟲的ITS片段大小為869bp之外,其它根結(jié)線蟲ITS片段均為766~772bp(圖1)。2.2價(jià)值補(bǔ)充酶切開劑的測(cè)定結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切后都得到1個(gè)與相應(yīng)ITS片段大小約同的片段(圖2)。這說(shuō)明質(zhì)粒的提取非常成功,是ITS片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆。2.3預(yù)防3個(gè)供試根結(jié)線蟲品長(zhǎng)度對(duì)所測(cè)定的序列進(jìn)行比對(duì)分析后,其結(jié)果表明,RKN-1、RKN-2、RKN-3、RKN-4、RKN-5、RKN-6、RKN-7和RKN-8等8個(gè)供試根結(jié)線蟲樣品ITS擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為768bp;RKN-9、RKN-10、RKN-11和RKN-16等4個(gè)供試根結(jié)線蟲樣品ITS擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為769bp;RKN-12供試根結(jié)線蟲樣品ITS擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為767bp;RKN-13供試根結(jié)線蟲樣品ITS擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為772bp;RKN-14供試根結(jié)線蟲樣品ITS擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為869bp;RKN-15供試根結(jié)線蟲樣品ITS擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為776bp。供試16個(gè)不同種群根結(jié)線蟲ITS序列的聚類分析結(jié)果見圖3。3orpse-pcr擴(kuò)增檢測(cè)根結(jié)線蟲擴(kuò)增根結(jié)線蟲的分類和鑒定是從事根結(jié)線蟲一切研究的前提和基礎(chǔ)。隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整,農(nóng)業(yè)正在向優(yōu)質(zhì)高效和集約化規(guī)模化方向發(fā)展,高附加值的經(jīng)濟(jì)作物種植面積的比重逐年上升,復(fù)種指數(shù)增加使得根結(jié)線蟲的發(fā)生危害有逐年加重的趨勢(shì)。在田間,危害農(nóng)作物的根結(jié)線蟲往往是3~4種混合發(fā)生,根結(jié)線蟲的新寄主和新的種類的不斷發(fā)現(xiàn)使得常規(guī)形態(tài)學(xué)鑒定和診斷變得越來(lái)越困難,這就需要其它的方法來(lái)對(duì)根結(jié)線蟲進(jìn)行分類鑒定。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,采用PCR方法對(duì)根結(jié)線蟲某段具有種特異性的DNA進(jìn)行序列分析,為根結(jié)線蟲的鑒定和分類提供了行之有效的方法。目前,PCR技術(shù)在寄生蟲學(xué)領(lǐng)域已得到日益廣泛和深入的應(yīng)用,尤其是近幾年來(lái)用于寄生蟲分子分類學(xué)和分子遺傳學(xué)等方面的研究已取得了很大的成功。PCR技術(shù)用于寄生蟲分子分類學(xué)的研究中,選擇合適的靶序列至關(guān)重要。ITS是核糖體DNA中介于18S和28S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū),包括ITS-1和ITS-2兩段序列,它們?cè)谏镞M(jìn)化過(guò)程中顯示種的特征,在種內(nèi)具有高度保守性,在不同種間又有不同程度的變異,是最廣泛應(yīng)用于寄生蟲種間分類鑒定的理想遺傳標(biāo)記。本研究對(duì)根結(jié)線蟲的ITS序列進(jìn)行了測(cè)定與比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)我國(guó)農(nóng)作物和蔬菜上的根結(jié)線蟲主要還是4種常見的根結(jié)線蟲:南方根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲,但是在海南安定縣還是存在特殊的根結(jié)線蟲種類(番禺根結(jié)線蟲),它的ITS區(qū)域與其它根結(jié)線蟲有明顯的不同。通過(guò)對(duì)這16個(gè)根結(jié)線蟲樣品ITS序列進(jìn)行比對(duì)和聚類分析,發(fā)現(xiàn)北京密云的苦瓜和豇豆,北京通州月季和山東3個(gè)地區(qū)花生上的根結(jié)線蟲都屬于北方根結(jié)線蟲;云南番茄、成都黃瓜和海南石榴上的根結(jié)線蟲則屬于爪哇根結(jié)線蟲;河北廊坊番茄、北京海淀番茄和浙江黃瓜上的根結(jié)線蟲則屬于花生根結(jié)線蟲;而安徽宿州和和縣番茄以及太和桔梗上根結(jié)線蟲則屬于南方根結(jié)線蟲;唯一1個(gè)不屬于4種常見根結(jié)線蟲的樣品是海南胡椒上的根結(jié)線蟲。通過(guò)序列比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)它與番禺根結(jié)線蟲的同源性達(dá)到97%。由此可見它屬于番禺根結(jié)線蟲。廖金鈴教授曾經(jīng)克隆和測(cè)定了福建、廣東和海南等地區(qū)的根結(jié)線蟲的ITS序列,首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了番禺根結(jié)線蟲,并向NCBI提交了番禺根結(jié)線蟲的ITS序列(AY394719)。通過(guò)對(duì)根結(jié)線蟲ITS序列的克隆與測(cè)序,不僅可為我國(guó)各地和各種作物上的根結(jié)線蟲遺傳多樣性積