第2課時動物細胞融合技術與單克隆抗體知識點一動物細胞融合技術的概述基礎知識·雙基夯實特別提醒：動物細胞融合技術是制備單克隆抗體的基礎，制備單克隆抗體是動物細胞融合技術的應用?；顋學|巧|練1.動物細胞融合過程中既有細胞膜融合也有核的融合。(√)2．與植物原生質(zhì)體融合相比，動物細胞融合特有的誘導因素有聚乙二醇、滅活的病毒。(×)合|作|探|究1.什么是滅活？滅活病毒誘導融合的原理是什么？提示：滅活是指用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染能力，但是并不破壞這些病原體的抗原結構。滅活病毒誘導細胞融合的原理是病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。2．動物細胞融合與植物原生質(zhì)體融合的原理相同嗎？提示：相同，都依據(jù)細胞膜的流動性。課內(nèi)探究·名師點睛1．對動物細胞融合過程的理解(1)細胞融合的過程包括細胞膜的融合、細胞質(zhì)融合和細胞核融合，其中細胞膜的融合是細胞融合的先導，在細胞膜融合中體現(xiàn)出細胞膜具有一定的流動性。(2)動物細胞融合完成的標志：來自不同細胞的兩個或多個細胞核融合成一個細胞核。2．動物細胞融合與植物體細胞雜交的比較比較項目動物細胞融合(單克隆抗體制備)植物體細胞雜交(番茄—馬鈴薯植株)過程正常小鼠的處理(注射特定的抗原)原生質(zhì)體的制備(酶解法)動物細胞融合原生質(zhì)體的融合雜交瘤細胞的篩選和培養(yǎng)雜種細胞的篩選和培養(yǎng)提純單克隆抗體(特異性強、靈敏度高)雜種植株鑒定原理細胞膜的流動性、細胞增殖細胞膜的流動性、植物細胞的全能性融合前處理注射特定抗原，免疫處理正常小鼠酶解法去除細胞壁：纖維素酶、果膠酶誘導方法(1)物理法：電融合法等(2)化學法：PEG融合法等(3)生物法：滅活病毒誘導法等(1)物理法：電融合法、離心法等(2)化學法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法等意義和用途(1)制備單克隆抗體(2)有助于疾病的診斷、治療、預防(1)克服不同物種間遠緣雜交不親和的障礙(2)培育作物新品種病毒在生物技術中的應用(1)滅活的病毒能作為誘導劑，不滅活的病毒不能作為誘導劑。(2)病毒在不同過程或操作中的“身份不同”。在免疫調(diào)節(jié)中病毒屬于抗原，在基因工程中可作為載體，在細胞工程中可作為(細胞融合的)誘導劑。典例1下列選項中關于動物細胞融合的說法，錯誤的是(C)A．動物細胞融合也稱細胞雜交，是指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的過程B．動物細胞融合后形成的具有兩個動物細胞遺傳信息的單核細胞稱為雜交細胞C．常用的誘導動物細胞融合的方法有聚乙二醇、滅活的病毒誘導、電融合、紫外線照射等D．細胞融合技術突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交成為可能解析：常用的誘導動物細胞融合的方法有物理法—電融合法；化學法—聚乙二醇(PEG)；生物法—滅活的病毒誘導。紫外線照射不是誘導動物細胞融合的方法。變式訓練?動物細胞融合的目的中最重要的是(B)A．克服遠緣雜交不親和的障礙B．制備單克隆抗體C．培育新物種D．生產(chǎn)雜交細胞解析：植物體細胞雜交主要是為了克服遠緣雜交不親和的障礙，以培育新品種；植物體細胞雜交還應用了植物體細胞的全能性；動物細胞的全能性受到限制，目前還未見到融合細胞表現(xiàn)出全能性的例子，因此動物細胞融合不能用來培育新物種；生產(chǎn)雜交細胞不是細胞融合的主要目的，雜交細胞只是細胞融合完成后所形成的結構名稱。知識點二單克隆抗體及其應用基礎知識·雙基夯實1．原理：一種B淋巴細胞在抗原的刺激下，只能產(chǎn)生一種針對這種抗原的特異性抗體。骨髓瘤細胞能夠無限增殖，B淋巴細胞與其融合后形成的_雜交瘤__細胞既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生單一抗體。2．制備過程3．優(yōu)點：準確識別抗原的細微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結合，并且可以大量制備。4．應用(1)單克隆抗體可用作診斷試劑，在多種疾病的診斷和病原體鑒定中發(fā)揮重要的作用。(2)單克隆抗體與某些藥物可組成“生物導彈”實現(xiàn)對目標細胞的定向殺傷，其中單克隆抗體發(fā)揮導向作用，將藥物帶到靶細胞。(3)單克隆抗體自身也能用于治療疾病?；顋學|巧|練1.用特定的抗原對小鼠進行免疫后，從小鼠脾臟中只能得到一種B淋巴細胞。(×)2．單克隆抗體是單個B淋巴細胞增殖并產(chǎn)生的抗體。(×)3．單克隆抗體制備過程中的兩次篩選目的相同。(×)合|作|探|究1.制備單克隆抗體的過程中的幾種細胞，如免疫的B淋巴細胞、骨髓瘤細胞、雜交瘤細胞各有何特點？提示：免疫的B淋巴細胞：能產(chǎn)生單一抗體，但不能無限增殖；骨髓瘤細胞：能無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體；雜交瘤細胞：既能產(chǎn)生特定的抗體，又能在組織培養(yǎng)條件下進行無限增殖。2．細胞內(nèi)DNA的合成一般有兩條途徑，主要途徑是在細胞內(nèi)由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，而氨基蝶呤可以阻斷此途徑。輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)酶的催化作用合成DNA，而骨髓瘤細胞的DNA合成沒有此輔助途徑。如何利用DNA合成途徑不同的特點配制培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞？請說明原理。提示：在培養(yǎng)基中加氨基蝶呤就可以篩選出雜交瘤細胞。因為培養(yǎng)基中加入氨基蝶呤后，骨髓瘤細胞和兩兩融合的骨髓瘤細胞由于其唯一的DNA合成途徑被抑制而不能增殖。B淋巴細胞本身不增殖，兩兩融合的B淋巴細胞也不增殖，只有雜交瘤細胞通過輔助途徑合成DNA進行增殖。課內(nèi)探究·名師點睛1．單克隆抗體制備過程的要點分析項目步驟技術方法原理取材從已免疫的小鼠的脾中獲取能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞、體外培養(yǎng)骨髓瘤細胞動物細胞培養(yǎng)細胞增殖融合通過滅活的病毒等誘導B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合動物細胞融合細胞膜的流動性篩選第一次要從融合形成的雜交細胞中篩選出雜交瘤細胞選擇培養(yǎng)基—第二次要從雜交瘤細胞中篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細胞專一性抗體檢測、克隆化培養(yǎng)免疫學原理(抗原—抗體特異性結合)培養(yǎng)在小鼠腹腔內(nèi)進行體內(nèi)培養(yǎng)，或在細胞培養(yǎng)液中進行體外培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)細胞增殖提取從小鼠腹水中或從培養(yǎng)液中獲得單抗——2.兩種抗體的比較名稱產(chǎn)生特點血清抗體由漿細胞分泌一般從血清中分離，產(chǎn)量低、純度低、特異性差單克隆抗體由雜交瘤細胞分泌特異性強，靈敏度高，能大量制備3.三種細胞的比較細胞類型來源特點漿細胞由B淋巴細胞受抗原刺激后增殖分化而來能產(chǎn)生單一抗體，但不能無限增殖骨髓瘤細胞從骨髓腫瘤中提取能無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體雜交瘤細胞漿細胞與骨髓瘤細胞融合而成既能產(chǎn)生抗體，又能無限增殖4.單克隆抗體制備過程中兩次篩選的區(qū)別項目第一次篩選第二次篩選篩選原因誘導融合后會得到多種雜交細胞，另外還有未融合的細胞由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經(jīng)選擇性培養(yǎng)獲得的雜交瘤細胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細胞篩選方法用特定的選擇培養(yǎng)基篩選：在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細胞和同種細胞融合后形成的細胞(“BB”細胞、“瘤瘤”細胞)都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞(“B瘤”細胞)才能生長用多孔板培養(yǎng)，在每個孔只有一個雜交瘤細胞的情況下開始克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選得到能產(chǎn)生特異性抗體的細胞群篩選目的得到雜交瘤細胞得到能分泌所需抗體的雜交瘤細胞典例2下列有關單克隆抗體的制備的敘述，正確的是(D)A．小鼠骨髓瘤細胞染色體數(shù)為40，其B淋巴細胞的染色體數(shù)為40，融合后形成的雜交瘤細胞DNA分子數(shù)為80B．在單克隆抗體的制備過程中，只有一次篩選C．單克隆抗體的制備需要用到動物細胞培養(yǎng)、動物細胞融合和動物體細胞核移植等技術D．B淋巴細胞與骨髓瘤細胞經(jīng)細胞融合后有三種細胞類型(若僅考慮兩兩融合的情況)解析：小鼠骨髓瘤細胞染色體數(shù)為40，其B淋巴細胞的染色體數(shù)為40，融合后形成的雜交瘤細胞染色體數(shù)目為80，由于線粒體中也有DNA，所以DNA數(shù)目大于80，A項錯誤；在單克隆抗體的制備過程中，至少涉及兩次篩選，B項錯誤；單克隆抗體的制備需要用到動物細胞培養(yǎng)、動物細胞融合等技術，不涉及動物體細胞核移植等技術，C項錯誤；B淋巴細胞與骨髓瘤細胞經(jīng)細胞融合后有三種兩兩融合的細胞類型，即雜交瘤細胞、B淋巴細胞—B淋巴細胞、骨髓瘤細胞—骨髓瘤細胞，D項正確。變式訓練?人絨毛膜促性腺激素(HCG)是懷孕后胎盤滋養(yǎng)層細胞分泌的一種糖蛋白，通過制備抗HCG單克隆抗體測試人體尿液中的HCG，可用于早孕的診斷。如圖是抗HCG單克隆抗體制備示意圖，相關敘述正確的是(C)A．①過程常用滅活的病毒，不可用聚乙二醇B．②過程篩選出的雜交瘤細胞都能產(chǎn)生抗HCG抗體C．③過程以抗HCG單克隆抗體為抗原進行檢測D．④過程要保持無毒環(huán)境，以防止細菌、病毒等污染解析：動物細胞融合可以用滅活的病毒誘導處理，也可以用聚乙二醇誘導融合，A錯誤；②過程篩選出的雜交瘤細胞不一定全部產(chǎn)生抗HCG抗體，還需要進行專一抗體檢測，B錯誤；③過程以抗HCG單克隆抗體為抗原，利用抗原—抗體雜交的原理進行檢測，C正確；④過程要保持無菌環(huán)境，以防止細菌、病毒等污染，D錯誤。一、雜交瘤細胞與單克隆抗體雜交瘤細胞的抗體檢測和克隆化培養(yǎng)融合后的細胞經(jīng)選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細胞就是雜交瘤細胞。但這些雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細胞稀釋，用96孔板培養(yǎng)，使每孔細胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體(常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法)，那些上清液可與特定抗原結合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，挑選陽性孔的細胞繼續(xù)進行有限稀釋，一般需進行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細胞為單克隆細胞。該過程即為雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。二、培養(yǎng)雜交瘤細胞的方法項目腹腔培養(yǎng)體外培養(yǎng)優(yōu)點易于控制培養(yǎng)條件，成本較低可大規(guī)模培養(yǎng)、大量生產(chǎn)缺點規(guī)模小，產(chǎn)量少需要人為控制培養(yǎng)條件，成本相對較高三、獲取單克隆抗體的場所若在培養(yǎng)基中進行雜交瘤細胞培養(yǎng)，則從培養(yǎng)液中提?。蝗粼谛∈蠡蚱渌麆游锔骨恢信囵B(yǎng)，則從腹水中提取。典例3下圖為制備單克隆抗體過程示意圖，下列相關敘述錯誤的是(A)A．④中的篩選是為了獲得能產(chǎn)生多種抗體的雜交瘤細胞B．②中培養(yǎng)基應加入選擇性抑制骨髓瘤細胞DNA分子復制的物質(zhì)C．圖中有一處明顯錯誤D．⑤可以無限增殖解析：④中的篩選是為了獲得能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞，A錯誤；②中培養(yǎng)基應加入選擇性抑制骨髓瘤細胞DNA分子復制的物質(zhì)，這樣才更容易篩選出雜交瘤細胞，B正確；題圖中的小鼠沒有經(jīng)過免疫處理，應該注射相應的抗原，小鼠才能形成相應的B淋巴細胞，C正確；⑤是能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞，能無限增殖，D正確。學|霸|記|憶1.動物細胞融合是指使兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的過程。2．動物細胞融合常用的誘導方法有PEG融合法、電融合法和滅活病毒誘導法。3．動物細胞融合的主要用途是制備單克隆抗體。4．雜交瘤細胞是由經(jīng)免疫的B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合而成的，具有既能無限增殖又能產(chǎn)生專一抗體的能力。5．制備單克隆抗體過程中第一次篩選是為了獲得雜交瘤細胞，第二次篩選是為了獲得能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞。6．單克隆抗體最主要的優(yōu)點是特異性強、靈敏度高，并可大量制備。7．單克隆抗體的主要用途有：作為診斷試劑、用于治療疾病和運載藥物。1．下列有關植物體細胞雜交與動物細胞融合的比較，敘述正確的是(B)A．兩者應用的原理都完全相同B．兩者都可用電融合法或聚乙二醇(PEG)融合法誘導細胞融合C．兩者融合完成的標志都是形成融合細胞核D．兩者的目的都是用于大量生產(chǎn)分泌蛋白解析：植物體細胞雜交的原理是細胞膜具有流動性和植物細胞具有全能性，動物細胞融合的原理是細胞膜具有流動性；電融合法或聚乙二醇(PEG)融合法既可誘導動物細胞融合，也可誘導植物原生質(zhì)體融合；植物原生質(zhì)體融合完成的標志是雜種細胞再生出細胞壁，動物細胞融合完成的標志是形成融合細胞核；植物體細胞雜交的目的是產(chǎn)生雜種植株，動物細胞融合可用于大量生產(chǎn)分泌蛋白等。2．新型冠狀病毒可通過表面的刺突蛋白(S蛋白)與人呼吸道黏膜上皮細胞的ACE2受體結合，侵入人體，引起肺炎。制備抗S蛋白的單克隆抗體可阻斷病毒的黏附或入侵，相關敘述正確的是(B)A．優(yōu)先選擇滅活的新冠病毒免疫小鼠以激活小鼠的免疫細胞B．用滅活的仙臺病毒誘導已免疫的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合C．經(jīng)過第一次篩選獲得能產(chǎn)生抗S蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞D．經(jīng)體外培養(yǎng)得到的單克隆抗體可以與ACE2受體結合阻斷病毒的入侵解析：研制抗S蛋白單克隆抗體，需要優(yōu)先選擇S蛋白免疫小鼠以激活小鼠的免疫細胞，A錯誤；誘導免疫的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合可用滅活的仙臺病毒，B正確；至少經(jīng)過兩次篩選才能獲得產(chǎn)生抗S蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞，C錯誤；經(jīng)體外培養(yǎng)得到的單克隆抗體可以與S蛋白結合阻斷病毒的入侵，D錯誤。3．為研制抗病毒A的單克隆抗體，某同學以小鼠甲為實驗材料設計了以下實驗流程。回答下列問題：(1)上述實驗前必須給小鼠甲注射病毒A，該處理的目的是_注射抗原，促進小鼠產(chǎn)生能分泌特定抗體的B淋巴細胞__。(2)寫出以小鼠甲的脾臟為材料制備單細胞懸液的主要實驗步驟：_從小鼠甲體內(nèi)取出脾臟，剪碎，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理一段時間(或