第六期全省質(zhì)監(jiān)系統(tǒng)食品質(zhì)量安全檢驗(yàn)人員（微生物）培訓(xùn)班

食品微生物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院

國(guó)家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心

劉新梅

2023/12/101●食品微生物實(shí)驗(yàn)室的基本要求

●微生物檢驗(yàn)人員的工作規(guī)范

●微生物檢驗(yàn)的基礎(chǔ)知識(shí)2023/12/102一、食品微生物實(shí)驗(yàn)室的基本要求GB4789.1—2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:Generalguidelines

3.1環(huán)境3.2人員3.3設(shè)備3.4檢驗(yàn)用品3.5培養(yǎng)基、試劑及菌種2023/12/1033.1環(huán)境3.1.1實(shí)驗(yàn)室環(huán)境不應(yīng)影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.1.2實(shí)驗(yàn)室的工作區(qū)域應(yīng)與辦公室區(qū)域明顯分開(kāi)。3.1.3實(shí)驗(yàn)室工作面積和總體布局應(yīng)能滿(mǎn)足從事檢驗(yàn)工作的需要，實(shí)驗(yàn)室布局應(yīng)采用單方向工作流程，避免交叉污染。3.1.4實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境的溫度、濕度、照度、噪聲和潔凈度等應(yīng)符合工作要求。3.1.5一般樣品檢驗(yàn)應(yīng)在潔凈區(qū)域[包括超凈工作臺(tái)或潔凈實(shí)驗(yàn)室]進(jìn)行，潔凈區(qū)域應(yīng)有明顯的標(biāo)示。

3.1.6病原微生物分離鑒定工作應(yīng)在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室（Biosafetylevel2,BSL-2）進(jìn)行。2023/12/104實(shí)驗(yàn)室的分類(lèi)、分級(jí)及適用范圍實(shí)驗(yàn)室分級(jí)根據(jù)所操作的生物因子的危害程度和采取的防護(hù)措施，將生物安全防護(hù)水平分為四級(jí)。各級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物防護(hù)水平依次為：一級(jí)最低，四級(jí)最高。2023/12/105生物安全防護(hù)水平（BSL）一級(jí)生物安全防護(hù)水平（BSL－1）二級(jí)生物安全防護(hù)水平（BSL－2）三級(jí)生物安全防護(hù)水平（BSL－3）四級(jí)生物安全防護(hù)水平（BSL－4）2023/12/106實(shí)驗(yàn)室的分類(lèi)、分級(jí)及適用范圍實(shí)驗(yàn)室各級(jí)定義及適用范圍一級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室

實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對(duì)健康成年人已知無(wú)致病作用的微生物，如用于教學(xué)的普通微生物實(shí)驗(yàn)室等。2023/12/107一級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室

BSL－1：

不需要特殊的防護(hù)屏障、除需要洗手池外，依靠標(biāo)準(zhǔn)的微生物操作即可獲得基本的防護(hù)水平。2023/12/108一級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室2023/12/109實(shí)驗(yàn)室的分類(lèi)、分級(jí)及適用范圍實(shí)驗(yàn)室各級(jí)定義及適用范圍二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室

實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對(duì)人或環(huán)境具有中等潛在危害的微生物。如臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室等。

普通微生物實(shí)驗(yàn)室加上使用生物安全柜。2023/12/1010BSL－2：安全設(shè)備(一級(jí)屏障)

在BSL-1設(shè)施基礎(chǔ)上增加:生物安全柜（BSC，二級(jí)）：在涉及下例情況，從事感染性生物因子工作時(shí)應(yīng)該使用氣溶膠和飛濺大容量培養(yǎng)高濃度2023/12/1011BSL－2：安全設(shè)備(一級(jí)屏障)在BSL-1設(shè)施的基礎(chǔ)上，增加:高壓滅菌鍋眼睛清洗站2023/12/1012二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室典型的二級(jí)生物安全水平實(shí)驗(yàn)室（圖片由CUH2A，Princeton，NJ，USA提供）。在生物安全柜中進(jìn)行可能發(fā)生氣溶膠的操作程序。門(mén)保持關(guān)閉并貼上適當(dāng)?shù)奈ｋU(xiǎn)標(biāo)志。潛在被污染的廢棄物同普通廢棄物隔開(kāi)。2023/12/1013二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室基本生物安全設(shè)備

1、移液輔助器——避免用口吸的方式移液。有不同設(shè)計(jì)的多種產(chǎn)品可供使用。

2、生物安全柜，在以下情況使用：—— 處理感染性物質(zhì)；如果使用密封的安全離心杯，并在生物安全柜內(nèi)裝樣、取樣，則這類(lèi)材料可在開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室離心—— 空氣傳播感染的危險(xiǎn)增大時(shí)—— 進(jìn)行極有可能產(chǎn)生氣溶膠的操作時(shí)（包括離心、研磨、混勻、劇烈搖動(dòng)、超聲破碎、打開(kāi)內(nèi)部壓力和周?chē)h(huán)境壓力不同的盛放有感染性物質(zhì)的容器、動(dòng)物鼻腔接種以及從動(dòng)物或卵胚采集感染性組織）。

3、一次性塑料接種環(huán)，也可在生物安全柜內(nèi)使用電加熱接種環(huán)，以減少生成氣溶膠。

4、螺口蓋試管及瓶子。

5、用于清除感染性材料污染的高壓滅菌器或其他適當(dāng)工具。

6、一次性塑料移液管，盡量避免使用玻璃制品。

7、在投入使用前，像高壓滅菌器和生物安全柜等設(shè)備必須用正確方法進(jìn)行驗(yàn)收。應(yīng)參照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)定期檢測(cè)。2023/12/1014實(shí)驗(yàn)室的分類(lèi)、分級(jí)及適用范圍實(shí)驗(yàn)室各級(jí)定義及適用范圍三級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室

實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于主要通過(guò)呼吸途徑使人傳染上嚴(yán)重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有預(yù)防傳染的疫苗。

2023/12/1015BSL－3：安全設(shè)備(一級(jí)屏障)在BSL-1and2安全設(shè)備的基礎(chǔ)上，加:

感染性材料的操作在II級(jí)或III級(jí)生物安全柜

呼吸道保護(hù)在二級(jí)生物安全防護(hù)水平上增加特殊防護(hù)服、進(jìn)入制度、定向氣流2023/12/1016三級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室

典型的三級(jí)生物安全水平實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室與公共通道分開(kāi)并通過(guò)緩沖間（雙門(mén)入口或二級(jí)生物安全水平的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室）或氣鎖室進(jìn)入。處理廢棄物前，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)先進(jìn)行高壓滅菌以清除污染。應(yīng)有非手控的水槽。形成向內(nèi)氣流而且涉及感染性材料的全部工作應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。在二級(jí)生物安全防護(hù)水平上增加特殊防護(hù)服、進(jìn)入制度、定向氣流2023/12/1017實(shí)驗(yàn)室的分類(lèi)、分級(jí)及適用范圍實(shí)驗(yàn)室各級(jí)定義及適用范圍四級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室

實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對(duì)人體具有高度的危險(xiǎn)性，通過(guò)氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無(wú)有效的疫苗或治療方法的致病微生物及其毒素。與上述情況類(lèi)似的不明微生物，也必須在四級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。待有充分?jǐn)?shù)據(jù)后再?zèng)Q定此種微生物或毒素應(yīng)在四級(jí)還是在較低級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室中處理。2023/12/1018最高防護(hù)實(shí)驗(yàn)室——四級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室操作：在三級(jí)生物安全防護(hù)水平上增加氣鎖入口、出口淋浴、污染物安全設(shè)施：Ⅲ級(jí)BSC或Ⅱ級(jí)BSC并穿著正壓服、雙開(kāi)門(mén)高壓滅菌器（穿過(guò)墻體）、經(jīng)過(guò)濾的空氣2023/12/10193.2人員3.2.1檢驗(yàn)人員應(yīng)具有相應(yīng)的教育、微生物專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)經(jīng)歷，具備相應(yīng)的資質(zhì)，能夠理解并正確實(shí)施檢驗(yàn)。3.2.2檢驗(yàn)人員應(yīng)掌握實(shí)驗(yàn)室生物檢驗(yàn)安全操作知識(shí)和消毒知識(shí)。

3.2.3檢驗(yàn)人員應(yīng)在檢驗(yàn)過(guò)程中保持個(gè)人整潔與衛(wèi)生，防止人為污染樣品。3.2.4檢驗(yàn)人員應(yīng)在檢驗(yàn)過(guò)程中遵守相關(guān)預(yù)防措施的規(guī)定，保證自身安全。3.2.5有顏色視覺(jué)障礙的人員不能執(zhí)行涉及到辨色的實(shí)驗(yàn)。一、食品微生物實(shí)驗(yàn)室的基本要求2023/12/10203.3設(shè)備3.3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)備應(yīng)滿(mǎn)足檢驗(yàn)工作的需要。

3.3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備應(yīng)放置于適宜的環(huán)境條件下，便于維護(hù)、清潔、消毒與校準(zhǔn)，并保持整潔與良好的工作狀態(tài)。3.3.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行檢查、檢定（加貼標(biāo)識(shí)）、維護(hù)和保養(yǎng)，以確保工作性能和操作安全。3.3.4實(shí)驗(yàn)設(shè)備應(yīng)有日常性監(jiān)控記錄和使用記錄。一、食品微生物實(shí)驗(yàn)室的基本要求2023/12/1021微生物檢測(cè)設(shè)施、設(shè)備一覽超凈工作臺(tái)或生物潔凈室微生物培養(yǎng)箱（36℃±1℃等

）天平：（感量0.1g，0.01g）電熱干燥箱（干熱滅菌）高壓滅菌鍋（濕熱滅菌）生物安全柜（最重要的安全設(shè)備，形成最主要的防護(hù)屏障）顯微鏡水浴鍋、冰箱、冰柜2023/12/10223.4檢驗(yàn)用品3.4.1常規(guī)檢驗(yàn)用品主要有接種環(huán)（針）、酒精燈、鑷子、剪刀、藥匙、消毒棉球、硅膠（棉）塞、微量移液器、吸管、吸球、試管、平皿、微孔板、廣口瓶、量筒、玻棒及L形玻棒等。

3.4.2檢驗(yàn)用品在使用前應(yīng)保持清潔和/或無(wú)菌。常用的滅菌方法包括濕熱法、干熱法、化學(xué)法等。3.4.3需要滅菌的檢驗(yàn)用品應(yīng)放置在特定容器內(nèi)或用合適的材料（如專(zhuān)用包裝紙、鋁箔紙等）包裹或加塞，應(yīng)保證滅菌效果。3.4.4可選擇適用于微生物檢驗(yàn)的一次性用品來(lái)替代反復(fù)使用的物品與材料（如培養(yǎng)皿、吸管、吸頭、試管、接種環(huán)等）。3.4.5檢驗(yàn)用品的儲(chǔ)存環(huán)境應(yīng)保持干燥和清潔,已滅菌與未滅菌的用品應(yīng)分開(kāi)存放并明確標(biāo)識(shí)。3.4.6滅菌檢驗(yàn)用品應(yīng)記錄滅菌/消毒的溫度與持續(xù)時(shí)間。2023/12/10233.5培養(yǎng)基和試劑3.5.1培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備和質(zhì)量控制按照GB/T4789.28的規(guī)定執(zhí)行。3.5.2試劑檢驗(yàn)試劑的質(zhì)量及配制應(yīng)適用于相關(guān)檢驗(yàn)。對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果有重要影響的關(guān)鍵試劑應(yīng)進(jìn)行適用性驗(yàn)證。3.6菌株3.6.1應(yīng)使用微生物菌種保藏專(zhuān)門(mén)機(jī)構(gòu)或同行認(rèn)可機(jī)構(gòu)保存的、可溯源的標(biāo)準(zhǔn)或參考菌株。3.6.2應(yīng)對(duì)從食品、環(huán)境或人體分離、純化、鑒定的，未在微生物菌種保藏專(zhuān)門(mén)機(jī)構(gòu)登記注冊(cè)的原始分離菌株（野生菌株）進(jìn)行系統(tǒng)、完整的菌株信息記錄，包括分離時(shí)間、來(lái)源，表型及分子鑒定的主要特征等。3.6.3實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需要的標(biāo)準(zhǔn)或參考菌株，在購(gòu)入和傳代保藏過(guò)程中，應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，并進(jìn)行文件化管理。2023/12/1024微生物檢驗(yàn)人員的工作規(guī)范■

無(wú)菌操作■生物安全2023/12/1025無(wú)菌操作（徹底滅菌、防止污染）無(wú)菌及無(wú)菌操作的概念：無(wú)菌是指在環(huán)境中一切有生命活動(dòng)的微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞及其芽孢或孢子都不存在的狀態(tài)。無(wú)菌操作是指在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行的細(xì)胞傳代培養(yǎng)、植物組織培養(yǎng)、細(xì)菌接種等操作,目的是防止微生物進(jìn)入人體組織或其他無(wú)菌范圍。泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。●無(wú)菌環(huán)境（無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)）●無(wú)菌材料（培養(yǎng)基和試劑、器皿、用具的滅菌）●防止污染，保持無(wú)菌狀態(tài)2023/12/1026無(wú)菌室

ⅰ、無(wú)菌室應(yīng)完全封閉，進(jìn)出無(wú)菌室至少要經(jīng)兩道門(mén)，中間隔有緩沖間，無(wú)菌室與外間設(shè)置一個(gè)可開(kāi)閉的窗口，用于傳遞器具。

2023/12/1027

ⅱ、無(wú)菌室必須保持整潔。工作人員進(jìn)入無(wú)菌室應(yīng)換專(zhuān)用鞋、專(zhuān)用衣。無(wú)菌室使用前須用紫外線(xiàn)消毒30min，操作結(jié)束后清潔臺(tái)面，再用紫外線(xiàn)消毒30min。定期用乳酸或甲醛熏蒸，徹底消毒。2023/12/1028

ⅲ、無(wú)菌室僅用于培養(yǎng)基分裝等無(wú)菌操作，不能進(jìn)行有菌標(biāo)本的操作。操作人員操作時(shí)應(yīng)嚴(yán)格關(guān)門(mén)，并戴好專(zhuān)用的手套、口罩、帽子、防護(hù)服等個(gè)人防護(hù)裝備

ⅳ、無(wú)菌室內(nèi)應(yīng)有空氣過(guò)濾裝置，并安裝空調(diào)。2023/12/1029微生物檢驗(yàn)人員的工作規(guī)范無(wú)菌操作要求食品微生物實(shí)驗(yàn)室工作人員，必須有嚴(yán)格的無(wú)菌觀念，微生物實(shí)驗(yàn)的許多試驗(yàn)要求在無(wú)菌條件下進(jìn)行，主要原因是防止試驗(yàn)操作中人為污染樣品。1．接種細(xì)菌時(shí)必須穿工作服、戴工作帽。2．進(jìn)行接種食品樣品時(shí)，必須穿專(zhuān)用的工作服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無(wú)菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線(xiàn)消毒后使用。3．接種食品樣品時(shí)，應(yīng)在進(jìn)無(wú)菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簟?．進(jìn)行接種所用的吸管，平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開(kāi)包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點(diǎn)燃燒灼三次后使用。5．從包裝中取出吸管時(shí)，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時(shí)，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。6．接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須在酒精燈前操作，接種細(xì)菌或樣品時(shí)，吸管從包裝中取出后及打開(kāi)試管塞都要通過(guò)火焰消毒。7．接種環(huán)和針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必要時(shí)還要燒到環(huán)和針與桿的連接處。8．吸管吸取菌液或樣品時(shí)，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。2023/12/1030微生物檢驗(yàn)人員的工作規(guī)范9無(wú)菌間使用要求1）無(wú)菌間內(nèi)應(yīng)保持清潔，工作后用消毒液擦拭工作臺(tái)面，不得存放與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的物品。2)無(wú)菌間使用前后應(yīng)將門(mén)關(guān)緊，打開(kāi)紫外燈，如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時(shí)，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時(shí)間不少于30min，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線(xiàn)穿透的影響。處理和接種食品標(biāo)本時(shí)，進(jìn)入無(wú)菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過(guò)傳遞窗傳遞。定期對(duì)無(wú)菌間進(jìn)行沉降菌的監(jiān)測(cè)和記錄。2023/12/1031檢查無(wú)菌操作是否規(guī)范的直接方法------空白對(duì)照根據(jù)GB4789.2菌落總數(shù)測(cè)定，將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml滅菌生理鹽水滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對(duì)照?？瞻讓?duì)照的結(jié)果至少可以說(shuō)明三個(gè)問(wèn)題：（1）實(shí)驗(yàn)所使用的材料滅菌是否徹底，儲(chǔ)存是否合理得當(dāng)。（2）無(wú)菌室的空氣條件是否達(dá)到要求。（3）操作人員的無(wú)菌操作技術(shù)是否規(guī)范。由此可見(jiàn)，通過(guò)空白對(duì)照可直接檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)器皿、實(shí)驗(yàn)條件以及實(shí)驗(yàn)人員是否符合無(wú)菌操作的規(guī)定。如果從空白對(duì)照中看出無(wú)菌操作不規(guī)范，通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步找出原因所在，最終達(dá)到規(guī)范的無(wú)菌操作。2023/12/1032微生物檢驗(yàn)人員的工作規(guī)范生物安全什么是生物危害？從廣義上：指有害或有潛在危害的生物因子對(duì)人、環(huán)境、生態(tài)和社會(huì)造成的危害或潛在危害。而狹義上：指在微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究過(guò)程中對(duì)工作人員造成的危害和對(duì)環(huán)境造成的污染。2023/12/1033生物安全GB19489-2004標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)涵:

對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全的通用要求，以保障工作人員充分避免所操作生物因子的危害，保證危險(xiǎn)生物因子不向?qū)嶒?yàn)室外擴(kuò)散?！吧锇踩R(shí)、防護(hù)技術(shù)的加強(qiáng)和安全設(shè)備的使用，對(duì)于防止大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室感染的發(fā)生是非常有效的”。

2023/12/1034

微生物檢驗(yàn)人員生物安全工作行為

1、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止飲食、吸煙、處理隱形眼鏡、化妝及儲(chǔ)存食物；以移液器吸取液體，禁止口吸；非特殊情況，禁止使用針、注射器及其他利器，盡可能使用塑料器材代替玻璃器材，禁止用手處理破碎的玻璃器具。2、在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)穿著工作服或罩衫等防護(hù)服。離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，防護(hù)服必須脫下并留在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，不得穿著外出。用過(guò)的工作服應(yīng)先消毒后再洗滌。3、當(dāng)手可能接觸感染材料、污染的表面或設(shè)備時(shí)應(yīng)戴手套，必要時(shí)宜戴兩副手套。不得戴著手套離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。工作完全結(jié)束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。4、可能產(chǎn)生致病微生物氣溶膠或出現(xiàn)濺出的操作以及處理高濃度或大容量感染性從材料均應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，并使用個(gè)體防護(hù)設(shè)備。5、接觸微生物或含有微生物的物品后，脫掉手套后離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室要洗手。6、所有樣本、培養(yǎng)物和廢棄物應(yīng)被假定含有傳染性生物因子應(yīng)以安全方式處理和處置，如高壓滅活。需運(yùn)出實(shí)驗(yàn)室滅活的物品必須放在專(zhuān)用密閉容器內(nèi)。2023/12/1035

微生物檢驗(yàn)人員生物安全工作行為

1、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止飲食、吸煙、處理隱形眼鏡、化妝及儲(chǔ)存食物；以移液器吸取液體，禁止口吸；非特殊情況，禁止使用針、注射器及其他利器，盡可能使用塑料器材代替玻璃器材，禁止用手處理破碎的玻璃器具。2、在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)穿著工作服或罩衫等防護(hù)服。離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，防護(hù)服必須脫下并留在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，不得穿著外出。用過(guò)的工作服應(yīng)先消毒后再洗滌。3、當(dāng)手可能接觸感染材料、污染的表面或設(shè)備時(shí)應(yīng)戴手套，必要時(shí)宜戴兩副手套。不得戴著手套離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。工作完全結(jié)束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。4、可能產(chǎn)生致病微生物氣溶膠或出現(xiàn)濺出的操作以及處理高濃度或大容量感染性從材料均應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，并使用個(gè)體防護(hù)設(shè)備。5、接觸微生物或含有微生物的物品后，脫掉手套后離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室要洗手。6、所有樣本、培養(yǎng)物和廢棄物應(yīng)被假定含有傳染性生物因子應(yīng)以安全方式處理和處置，如高壓滅活。需運(yùn)出實(shí)驗(yàn)室滅活的物品必須放在專(zhuān)用密閉容器內(nèi)。2023/12/1036

微生物檢驗(yàn)的基礎(chǔ)知識(shí)

一、培養(yǎng)基的配制與滅菌二、微生物的顯微鏡檢查2023/12/10371、教學(xué)要求

1.1了解培養(yǎng)基的分類(lèi)

1.2了解并掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法

1.3掌握各種實(shí)驗(yàn)室滅菌方法及技術(shù)

培養(yǎng)基的配制與滅菌

2023/12/10382、原理

培養(yǎng)基是供微生物生長(zhǎng)、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類(lèi)很多，使用的原料也各有差異，但從營(yíng)養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。

2023/12/1039

瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應(yīng)用最廣的凝固劑。加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反復(fù)融化，其凝固性降低。

任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時(shí)徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。普通瓊脂培養(yǎng)基

2023/12/10403、分類(lèi)

3.1按照培養(yǎng)基的成分分為：

(1)合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基的各種成分完全是已知的各種化學(xué)物質(zhì)。這種培養(yǎng)基的化學(xué)成分清楚，組成成分精確，重復(fù)性強(qiáng)，但價(jià)格較貴，而且微生物在這類(lèi)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較慢。如高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基、察氏（Czapek）培養(yǎng)基等。

(2)天然培養(yǎng)基：由天然物質(zhì)制成，如蒸熟的馬鈴薯和普通牛肉湯，前者用于培養(yǎng)霉菌，后者用于培養(yǎng)細(xì)菌。這類(lèi)培養(yǎng)基的化學(xué)成分很不定，也難以確定，但配制方便，營(yíng)養(yǎng)豐富，所以常被采用。

(3)半合成培養(yǎng)基：在天然有機(jī)物的基礎(chǔ)上適當(dāng)加入已知成分的無(wú)機(jī)鹽類(lèi)，或在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加某些天然成分，如培養(yǎng)霉菌用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。這類(lèi)培養(yǎng)基能更有效地滿(mǎn)足微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需要。2023/12/10413.2按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分為：

(1)固體培養(yǎng)基：是在培養(yǎng)基中加入凝固劑，有瓊脂、明膠、硅膠等。固體培養(yǎng)基常用于微生物分離、鑒定、計(jì)數(shù)和菌種保存等方面。

(2)液體培養(yǎng)基：體培養(yǎng)基中不加任何凝固劑。這種培養(yǎng)基的成分均勻，微生物能充分接觸和利用培養(yǎng)基中的養(yǎng)料，適于作生理等研究，由于發(fā)酵率高，操作方便，也常用于發(fā)酵工業(yè)。

(3)半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑而呈半固體狀態(tài)?？捎糜谟^察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、鑒定菌種和測(cè)定噬菌體的效價(jià)等方面。常用凝固劑為瓊脂（其次為明膠），又叫洋菜、凍粉。

2023/12/10423.3按照微生物的種類(lèi)分為：

細(xì)菌培養(yǎng)基、放線(xiàn)菌培養(yǎng)基、酵母菌培養(yǎng)基和霉菌培養(yǎng)基等四類(lèi)。常用的細(xì)菌培養(yǎng)基有營(yíng)養(yǎng)肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；常用的放線(xiàn)菌培養(yǎng)基為高氏1號(hào)培養(yǎng)基；常用的酵母菌培養(yǎng)基有馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基；常用的霉菌培養(yǎng)基有馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）瓊脂培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基等。2023/12/1043微小毛霉菌落沙堡弱培養(yǎng)基酵母菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上

2023/12/10443.4按照培養(yǎng)基用途分為：

(1)加富培養(yǎng)基：是在培養(yǎng)基中加入血、血清、動(dòng)植物組織提取液，用以培養(yǎng)要求比較苛刻的某些微生物。

(2)選擇性培養(yǎng)基：是根據(jù)某一種或某一類(lèi)微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢?、化學(xué)抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來(lái)。

(3)鑒別培養(yǎng)基：是在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使培養(yǎng)后會(huì)發(fā)生某種變化，從而區(qū)別不同類(lèi)型的微生物。2023/12/10454操作流程和步驟1)稱(chēng)量及溶化2)調(diào)pH

3)加瓊脂、溶化、定容、（過(guò)濾）4)分裝、加塞、包扎5)滅菌（高壓蒸汽滅菌法）2023/12/10465.1培養(yǎng)基的制備

1、稱(chēng)量藥品:根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確稱(chēng)取各種藥品，放入適當(dāng)大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱(chēng)量時(shí)要迅速。

2、溶解：用量筒取一定量(約占總量的1/2)蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品完全溶解后，停止加熱，補(bǔ)足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，補(bǔ)足水分。

2023/12/1047

3

、調(diào)節(jié)pH

根據(jù)培養(yǎng)基對(duì)pH的要求，用5%NaOH或5%HCl溶液調(diào)至所需pH。測(cè)定pH可用pH試紙或酸度計(jì)等。

4

、溶化瓊脂

固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全融化后才能停止攪拌，并補(bǔ)足水分(水需預(yù)熱)。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。

2023/12/1048

5、過(guò)濾分裝

先將過(guò)濾裝置安裝好。如果是液體培養(yǎng)基，玻璃漏斗中放一層濾紙，如果是固體或半固體培養(yǎng)基，則需在漏斗中放多層紗布，或兩層紗布夾一層薄薄的脫脂棉趁熱進(jìn)行過(guò)濾。過(guò)濾后立即進(jìn)行分裝。分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過(guò)三角瓶容積的一半為宜。

2023/12/1049培養(yǎng)基的分裝（圖中是利用培養(yǎng)基分裝泵進(jìn)行分裝）2023/12/1050

6、包扎標(biāo)記

培養(yǎng)基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱(chēng)，制備組別和姓名、日期等。

7、滅菌

上述培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時(shí)進(jìn)行滅菌。普通培養(yǎng)基為121℃20min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長(zhǎng)度一般以不超過(guò)試管長(zhǎng)度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。

8、倒平板

將需倒平板的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到45～50℃,立刻倒平板2023/12/1051

5.2

滅菌方法和步驟

滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類(lèi)。本次課主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。

加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過(guò)加熱使菌體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到殺菌目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān)，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因?yàn)椋?1)在濕熱條件下，細(xì)菌吸收水分，使菌體蛋白質(zhì)易于凝固變性。(2)溫?zé)嵴魵獾拇┩噶Ρ雀蔁峥諝鈴?qiáng)，能較快提高滅菌物品內(nèi)部的溫度。(3)熱蒸氣與物品接觸，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出大量潛熱，能迅速提高滅菌物品的溫度。2023/12/10521濕熱滅菌

1、煮沸消毒法

注射器和解剖器械等均可采用此法。先將注射器等用紗布包好，然后放進(jìn)煮沸消毒器內(nèi)加水煮沸。對(duì)于細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)體煮沸約15～30min，對(duì)于芽孢則需煮沸約1～2h。

2、高壓蒸汽滅菌法

高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點(diǎn)隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計(jì)的。當(dāng)蒸汽壓力達(dá)到1.05kg/cm2時(shí)，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15～30min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌。2023/12/1053

3、操作方法和注意事項(xiàng)如下

（1）加水

打開(kāi)滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線(xiàn)。立式消毒鍋?zhàn)詈糜靡阎箝_(kāi)過(guò)的水，以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。注意水要加夠，防止滅菌過(guò)程中干鍋。

（2）裝料、加蓋

滅菌材料放好后，關(guān)閉滅菌器蓋，采用對(duì)角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。2023/12/1054

（3）

排氣

打開(kāi)排氣口(也叫放氣閥)。用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當(dāng)有大量蒸汽排出時(shí)，維持5min，使鍋內(nèi)冷空氣完全排凈（4）

升壓、保壓和降壓

當(dāng)鍋內(nèi)冷空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開(kāi)始上升。當(dāng)壓力上升至所需壓力時(shí)，控制電壓以維持恒溫，并開(kāi)始計(jì)算滅菌時(shí)間，待時(shí)間達(dá)到要求（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121℃，20min）后，停止加熱，待壓力降至接近“0”時(shí)，打開(kāi)放氣閥。注意不能過(guò)早過(guò)急地排氣，否則會(huì)由于瓶?jī)?nèi)壓力下降的速度比鍋內(nèi)慢而造成瓶?jī)?nèi)液體沖出容器之外。

2023/12/1055（5）滅菌后的培養(yǎng)基空白培養(yǎng)

滅菌后的培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)24h培養(yǎng)無(wú)菌生長(zhǎng)，可保存?zhèn)溆?；斜面培養(yǎng)基取出后，立即擺成斜面后空白培養(yǎng)；半固體的培養(yǎng)基垂直放置凝成半固體深層瓊脂后，空白培養(yǎng)。

2023/12/1056

2、干熱滅菌法

通過(guò)使用干熱空氣殺滅微生物的方法叫干熱滅菌。一般是把待滅菌的物品包裝就緒后，放入電烘箱中烘烤，即加熱至160～170℃維持1～2h。

干熱滅菌法常用于空玻璃器皿、金屬器具的滅菌。凡帶有膠皮的物品，液體及固體培養(yǎng)基等都不能用此法滅菌。用此法滅菌時(shí)，絕不能用油、蠟紙包扎物品溫度降至60～70℃時(shí)方可打開(kāi)箱門(mén)，取出物品，否則玻璃器皿會(huì)因驟冷而爆裂。2023/12/1057

3、火焰滅菌

直接用火焰灼燒滅菌，迅速?gòu)氐?。?duì)于接種環(huán)，接種針或其它金屬用具，可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進(jìn)行滅菌。此外，在接種過(guò)程中，試管或三角瓶口，也采用通過(guò)火焰而達(dá)到滅菌的目的。

2023/12/1058

6、注意事項(xiàng)

1、要嚴(yán)格按配方配制。

2、培養(yǎng)基分裝過(guò)程中注意不要使培養(yǎng)基沾管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。

3、使用滅菌鍋應(yīng)嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行。滅菌所需時(shí)間到后，要先切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時(shí)，才能打開(kāi)排氣閥。

4、每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄，包括培養(yǎng)基名稱(chēng)，配方及其來(lái)源和各種成分的牌號(hào)最終pH值、消毒的溫度和時(shí)間、制備的日期和制備者等，記錄應(yīng)復(fù)制一份原記錄保存?zhèn)洳?，?fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放，以防發(fā)生混亂。2023/12/1059

二、微生物的顯微鏡檢查微生物個(gè)體微小，其形態(tài)結(jié)構(gòu)用肉眼直接觀察不到，要利用顯微鏡。顯微鏡有不同類(lèi)型，如普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡等，其應(yīng)用目的是不同的，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)觀測(cè)項(xiàng)目不同選擇相應(yīng)的類(lèi)型。2023/12/1060

由于微生物細(xì)胞含有大量水分（一般在80%～90%以上），對(duì)光線(xiàn)的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周?chē)尘皼](méi)有明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和直接計(jì)算菌數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過(guò)染色后，才能在顯微鏡下進(jìn)行觀察。但是，任何一項(xiàng)技術(shù)都不是完美無(wú)缺的。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過(guò)程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會(huì)發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細(xì)胞的真實(shí)情況，染色觀察時(shí)必須注意。2023/12/1061

染色Ⅰ、染色的基本原理

微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學(xué)因素作用而進(jìn)行的。物理因素如細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等?；瘜W(xué)因素則是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生的各種化學(xué)反應(yīng)。細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，PH值大約在2～5之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶負(fù)電荷；而堿性染料電離時(shí)染料離子帶正電。

所以，在細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料進(jìn)行染色。2023/12/1062

影響染色的其他因素還有菌體細(xì)胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，如細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養(yǎng)基的組成、菌齡、染色液中的電介質(zhì)含量和PH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細(xì)菌的染色。2023/12/1063Ⅱ、染色方法

微生物的染色方法很多，各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過(guò)制片及一套染色操作程序，即：

制片、固定、媒染、染色、脫色、復(fù)染、水洗、干燥、鏡檢2023/12/1064

微生物染色方法一般分為單染色法和復(fù)染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物。復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染料，有協(xié)助鑒別微生物的作用。故亦稱(chēng)鑒別染色法。常用的復(fù)染色法有革蘭染色法和抗酸性染色法，此外還有鑒別細(xì)胞各部分結(jié)構(gòu)的（如芽孢、鞭毛、細(xì)胞核等）特殊染色法。2023/12/1065ⅰ、單染色法

用一種染色劑對(duì)涂片進(jìn)行染色，簡(jiǎn)便易行，適于進(jìn)行微生物的形態(tài)觀察。在一般情況下，常用堿性染料進(jìn)行單染色，如美蘭、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。使用酸性染料時(shí)，必須降低染液的PH值，使其呈現(xiàn)強(qiáng)酸性（低于細(xì)菌菌體等電點(diǎn)），讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。2023/12/1066染色結(jié)果依染料不同而不同：石碳酸復(fù)紅染色液：著色快，時(shí)間短，菌體呈紅色美蘭染色液：著色慢，時(shí)間長(zhǎng)，效果清晰，菌體呈蘭色

草酸銨結(jié)晶紫染色液：染色迅速，著色深，菌體呈紫色2023/12/1067

ⅱ、革蘭染色法

革蘭染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，