室旁核對神經(jīng)源性肺水腫發(fā)病的影響

神經(jīng)源性肺水腫（npe）是一種復(fù)發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的疾病。例如，常見的腦損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血、樹干損傷、急性腦缺血和缺氧腦損傷可合并肺水腫。以嚴(yán)重的情況、快速的進步和低效率為特征。以往研究表明交感神經(jīng)興奮,引起血液動力學(xué)的改變是NPE主要的外周原因,而中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變導(dǎo)致NPE的病理機制尚不十分清楚。組胺是中樞神經(jīng)遞質(zhì),腦內(nèi)組胺能神經(jīng)元胞體主要分布于下丘腦結(jié)節(jié)乳頭體核,其神經(jīng)纖維及受體在腦內(nèi)分布較廣泛,除了參與機體的多種功能調(diào)節(jié)外,還與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)。本實驗觀察NPE家兔模型室旁核(PVN)內(nèi)組胺含量變化,探討組胺在NPE發(fā)生過程中的作用,為揭示NPE發(fā)生的中樞機制以及對該病的預(yù)防和治療提供理論支持。1材料和方法1.1試劑和儀器成年健康家兔60只,體質(zhì)量2.0～2.4kg,雌雄不拘,由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。組胺二磷酸標(biāo)準(zhǔn)品系Sigma公司產(chǎn)品,甲醇為國產(chǎn)色譜純,磷酸和三氯乙酸為國產(chǎn)分析純,凝血酶系浙江杭康海洋生物藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品,纖維蛋白原系上海萊士血制品有限公司產(chǎn)品,撲爾敏系江蘇鹽城制藥有限公司產(chǎn)品,西米替丁系江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;蛋白質(zhì)定量試劑盒系南京建成生物制品公司產(chǎn)品;LC-6A型高效液相色譜儀為日本島津公司產(chǎn)品;722分光光度計由上海分析儀器廠生產(chǎn)。1.2方法1.2.1pvn的注射實驗動物隨機分為空白對照組(空白組)、假手術(shù)組、NPE模型組(NPE組)、H1受體拮抗劑組(H1組)、H2受體拮抗劑組(H2組)、生理鹽水組(NS組),每組10只家兔?？瞻捉M:動物麻醉(25%烏拉坦4ml/kg)后僅行氣管、動脈插管;NPE組:動物麻醉后氣管、動脈插管,在腦立體定位儀下行小腦延髓池穿刺注射凝血酶35U/kg和4%纖維蛋白原20mg/kg;H1組、H2組、NS組:參照Sawyer兔腦立體定向圖譜在腦立體定位儀下PVN埋置外套管(直徑0.6mm),用自凝牙托粉及502膠固定,小腦延髓池穿刺注射凝血酶和纖維蛋白原,經(jīng)內(nèi)套管(直徑0.3mm)分別向PVN注射撲爾敏(10μg)、西米替丁(10μg)及等體積(1μl)的生理鹽水;假手術(shù)組:小腦延髓池穿刺后不注射任何液體拔針。1.2.2組織勻漿、過濾實驗結(jié)束后,將動物放血處死,根據(jù)Sawyer兔腦立體定向圖譜迅速于冰臺上取PVN,精確稱重后,置于玻璃勻漿器中,加入預(yù)冷的10%三氯乙酸,制成1%組織勻漿,4℃、14000r/min離心10min,取上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后-20℃冰箱保存。用高效液相紫外線檢測法測定組胺含量,根據(jù)組胺標(biāo)準(zhǔn)品峰面積和濃度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性方程,根據(jù)方程計算樣品中組胺的含量(nmol/g)。1.2.3膜法檢測水腫蛋白表達水平實驗結(jié)束后自動物頸總動脈取血3ml,置于肝素化的離心管中,收集肺水腫液3ml,將水腫液和血液分別3000r/min離心10min,取上清液-20℃冰箱保存待測。用Lowery法測定蛋白含量,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。根據(jù)公式:A/P=肺水腫液蛋白含量/血漿蛋白含量,計算A/P值。1.2.4肺濕重的測定動物處死后,開胸取肺組織,根據(jù)肺水腫的程度將肺水腫分為4級:嚴(yán)重水腫(3個肺葉以上至兩肺嚴(yán)重瘀血、水腫)、中度水腫(水腫僅波及3個肺葉)、輕度水腫(僅有肺尖部水腫或兩肺散在灶性水腫)、未見水腫(未發(fā)現(xiàn)眼觀可見的水腫);準(zhǔn)確稱取肺濕重后將標(biāo)本置于70℃烤箱中烤48h至恒重,稱取肺干重。根據(jù)公式:肺水比=(肺濕重-肺干重)/肺干重,計算肺水比。1.2.5統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS10.0軟件進行。組間比較用t檢驗或χ2檢驗。2結(jié)果2.1各組大鼠nmol/gNPE組、NS組、空白組和假手術(shù)組PVN內(nèi)組胺含量分別為(321.81±25.77)、(332.96±26.06)、(136.45±23.59)、(157.12±17.51)nmol/g,NPE組和NS組與空白組和假手術(shù)組比較差異均有極顯著性(均P<0.001);而NPE組和NS組比較以及空白組和假手術(shù)組比較差異均無顯著性(均P>0.05)。2.2血清bs-p值空白組和假手術(shù)組動物無肺水腫液,肺內(nèi)少量液體的蛋白含量小于血漿蛋白的60%。NPE組、NS組、H2組動物出現(xiàn)肺水腫液,H1組也有動物出現(xiàn)少量肺水腫液,A/P值分別為0.80±0.15、0.81±0.10、0.78±0.12和0.58±0.14,H1組動物A/P值明顯低于NPE組和NS組、H2組(均P<0.01),而H2組與NPE組和NS組比較差異均無顯著性(均P>0.05)。2.3兩組比較結(jié)果H1組動物肺水腫程度與NPE組比較明顯減輕(P<0.01),而H2組與NPE組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。H1組動物肺水比與空白組、假手術(shù)組比較差異無顯著性(均P>0.05),NPE組、NS組和H2組肺水比均明顯高于H1組、空白組和假手術(shù)組(均P<0.01)。見表2。3pvn抗劑的用量和模型建立的意義NPE是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥,起病急驟,死亡率高。有研究顯示下丘腦可能是NPE發(fā)生的重要部位。腦內(nèi)組胺能神經(jīng)元胞體主要集中分布于下丘腦結(jié)節(jié)乳頭體核,其神經(jīng)纖維廣泛投射到各腦區(qū),PVN有大量組胺能神經(jīng)纖維投射,且該部位有組胺能受體分布。組胺能神經(jīng)系統(tǒng)作為機體對危險反應(yīng)的組織是在長期進化過程中保留下來的,中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷對機體來說是一種非常危險的信號,必然會引起腦內(nèi)組胺能神經(jīng)系統(tǒng)的興奮反應(yīng)。而PVN既是重要的心血管活動中樞,也是下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸活動的直接控制部位。本實驗通過向家兔小腦延髓池注射凝血酶和纖維蛋白原制作蛛網(wǎng)膜下腔出血后的NPE模型,發(fā)現(xiàn)發(fā)生NPE的動物PVN內(nèi)組胺含量明顯升高,提示NPE的發(fā)生與PVN的組胺含量變化之間存在一定關(guān)系。在PVN注射組胺H1、H2受體拮抗劑,發(fā)現(xiàn)H1受體拮抗劑可以減輕肺水腫的程度,降低肺水比,同時反映肺水腫液蛋白相對含量的A/P值下降,都說明肺血管的通透性下降;而H2受體拮抗劑則無明顯作用。以往認(rèn)為NPE是一種由于肺血管通透性增加的肺水腫,本實驗結(jié)果表明給予PVNH1受體拮抗劑可以降低肺血管的通透性,但其機制有待進一步研究。Brown等的研究結(jié)果顯示組胺對下丘腦很多神經(jīng)元的興奮是通過H1受體起作用的,本研究結(jié)果與之相符。因此,推測中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,引起下丘腦結(jié)節(jié)乳頭體核組胺能神經(jīng)元興奮,釋放大量組胺,作用于PVN的H1受體,引起該部位神經(jīng)元興奮,繼而引發(fā)肺水腫。但本研究也顯示給予PVNH1受體拮抗劑只是能減少NPE的發(fā)生率和降低肺水腫程度,表明此途徑可能不是引起NPE的惟一途徑,因此NPE的中樞發(fā)病機制有待進一步研究。有研究表明,PVN神經(jīng)元興奮可以引起交感神經(jīng)興奮的表現(xiàn),而且組織學(xué)和電生理學(xué)檢查表明PVN小細胞神經(jīng)元有直接長軸突投射纖維到達胸腰段脊髓中間外側(cè)柱與交感節(jié)前神經(jīng)元呈突觸聯(lián)系,也就為PVN能引起交感神經(jīng)興奮提供了形態(tài)和機能兩方面的理論支持;第三腦室注射組胺可以使PVN部位的促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素