膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物納米脂質(zhì)體的藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)評(píng)價(jià)目的:瘧原蟲感染的紅細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞的通性是膽堿代謝異常,基于此,本課題以膽堿衍生物為靶頭,合成膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物（artelinicacid-cholinederivative,AD）;制備膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物納米脂質(zhì)體（ADLs）,并對(duì)其進(jìn)行單因素處方優(yōu)化,考察其制劑學(xué)性質(zhì);對(duì)ADLs在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行初步的研究并分別評(píng)價(jià)ADLs對(duì)約氏鼠瘧（PlasmodiumyoeliiBY265,PyBY265）的抗瘧活性和ADLs對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的體內(nèi)外抗腫瘤活性。方法:1.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物的合成及表征以雙氫青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）為原料藥,通過脫水縮合反應(yīng)、水解反應(yīng)合成蒿醚林酸（artelinicacid,AA）,AA與季銨化膽堿衍生物通過酯化反應(yīng)得到膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物（AD）。采用傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FT-ICRMS）和核磁共振氫譜、碳譜(¹H-NMR,¹³C-NMR)確證其結(jié)構(gòu)。2.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物脂質(zhì)體的制備及處方優(yōu)化用高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography,HPLC）建立AD的體外分析方法;采用薄膜分散法制備ADLs,以包封率（encapsulationefficiency,EE）、載藥量（drugloadingefficiency,DL）、粒徑（size）及多分散性指數(shù)（polydispersityindex,PDI）為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察藥脂比、水化溫度以及膽固醇的用量對(duì)脂質(zhì)體處方的影響,以獲得較優(yōu)處方。通過透射電鏡（transmissionelectronmicroscopy,TEM）觀察ADLs的表面形態(tài),超濾離心法測(cè)定脂質(zhì)體的包封率,體外透析法測(cè)定脂質(zhì)體的體外釋放,并考察ADLs在一月內(nèi)的穩(wěn)定性。3.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究建立高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（highperformanceliquidchromatography-massspectrometry,HPLC-MS/MS）測(cè)定大鼠血漿中AD和AA的含量。將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組（n=6）,分別靜脈注射蒿醚林酸溶液（AA-SOL）、蒿醚林酸脂質(zhì)體（AALs）、AD溶液（AD-SOL）、ADLs,并分別于0.083,0.167,0.25,0.5,0.75,1,2,4,6,8,12和24h眼眶取血0.5ml于肝素管,在3500r/min離心10min以分離血漿,將上層血漿保存于-20℃冰箱中直至測(cè)定分析。4.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物脂質(zhì)體的體內(nèi)抗瘧藥效學(xué)研究以PyBY265感染小鼠為模型,以不治療組、空白脂質(zhì)體組為陰性對(duì)照組,以雙氫青蒿素脂質(zhì)體組（DHALs）、蒿醚林酸脂質(zhì)體組（AALS）、膽堿衍生物脂質(zhì)體組（CDLS）、AALs和CDLs的等摩爾物理混合脂質(zhì)體組（AALs-CDLs）為試驗(yàn)對(duì)照組,以感染率、抑制率、轉(zhuǎn)陰率、復(fù)燃率、存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過皮爾遜四天抑制法考察ADLs的體內(nèi)抗瘧活性。5.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物脂質(zhì)體的體內(nèi)外抗腫瘤活性研究通過MTT法評(píng)估ADLs對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的抑制作用;用懸浮的4T1細(xì)胞皮下接種Balb/C小鼠乳房,建立Balb/C荷瘤小鼠模型。以腫瘤生長(zhǎng)體積、小鼠體重、抑瘤率及生存曲線等為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過連續(xù)四次隔天給藥法,考察ADLs的體內(nèi)抗腫瘤活性。結(jié)果:1.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物的合成及表征FT-ICRMS測(cè)得的精確質(zhì)量數(shù)和理論值的相對(duì)誤差均在±3ppm之內(nèi),¹H-NMR和¹³C-NMR的圖譜結(jié)果與對(duì)應(yīng)化合物的結(jié)構(gòu)相一致,表明成功合成AD。其中,季銨化反應(yīng)生成CD產(chǎn)率為65.65%,AA產(chǎn)率為31.71%,過量的膽堿衍生物與AA發(fā)生酯化反應(yīng)生成的AD產(chǎn)率為63.31%。2.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物脂質(zhì)體的制備及處方優(yōu)化建立了HPLC法用于AD的含量測(cè)定及其制劑的體外分析,經(jīng)過分析方法的驗(yàn)證,在2¹200μg/ml的濃度范圍內(nèi),AD的線性關(guān)系良好;AD定量限為1.5μg/ml,檢測(cè)限為1.0μg/ml;方法的精密度、回收率均符合方法學(xué)要求。通過單因素法確定了最佳脂質(zhì)體處方為:藥脂比1:10,水化溫度40℃,膽固醇與磷脂之比1:25。在該處方下,ADLs外觀透亮,透射電鏡下顯示該脂質(zhì)體呈圓形或近圓形;ADLs的平均粒徑為（164.4±1.8）nm,Zeta電位為（40.87±0.86）mV;超濾法測(cè)得包封率為（95.74±0.10）%,計(jì)算得載藥量為（12.60±0.05）%;ADLs的體外釋放行為顯示,脂質(zhì)體具有較好的緩釋特征,在12h內(nèi)釋放量達(dá)48.93%,無(wú)明顯突釋現(xiàn)象。3.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物納米脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究所建立的HPLC-MS/MS法符合方法學(xué)要求,可用于測(cè)定大鼠血漿中AD和AA的含量。藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示,ADLs的AUC,t_1/2,CLz,Vz分別是AD-SOL的4.54、2.09、0.23、0.55倍,AALs的AUC,t_1/2,CLz,Vz分別是AA-SOL的2.57,1.94,0.38,0.68,這個(gè)結(jié)果說明,納米脂質(zhì)體相比溶液劑可以增加藥物的AUC、延長(zhǎng)生物半衰期、減少清除率和表觀分布容積;相比AA的溶液劑和脂質(zhì)體組,AD的溶液劑和脂質(zhì)體組的AUC和t_1/2都顯著增加,CLz和Vz顯著減少。4.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物納米脂質(zhì)體的體內(nèi)抗瘧藥效學(xué)研究空白脂質(zhì)體組、溶劑組、感染不治療組對(duì)瘧原蟲的感染率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）,說明空白脂質(zhì)體組和溶劑組對(duì)瘧原蟲無(wú)抑制作用。各制劑組的感染率、抑制率、轉(zhuǎn)陰率、復(fù)燃率、存活率、ED₅₀和ED₉₀結(jié)果表明,各制劑組的抗瘧順序?yàn)锳DLs>DHALs>AALs>AALs-CDLs>CDLs。5.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物納米脂質(zhì)體的體內(nèi)外抗腫瘤活性研究MTT試驗(yàn)顯示,ADLs對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞（4T1）的細(xì)胞毒性呈時(shí)間和濃度依賴關(guān)系,順序依次為:DHA-SOL>ADLs>AA-SOL>生理鹽水組;體內(nèi)抗腫瘤活性結(jié)果表明各組抑制腫瘤生長(zhǎng)順序依次為:ADLs>DHA-SOL>AA-SOL>生理鹽水組。結(jié)論:1.成功合成膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復(fù)合物,并用FT-ICRMS、¹H-NMR和¹³C-NMR確證了其結(jié)構(gòu)。2.采用單因素優(yōu)化后的處方制備ADLs,該脂質(zhì)體的形態(tài)、粒徑及其分布、EE、DL、穩(wěn)定性和釋放度等指標(biāo)都符合預(yù)期的要求。3.藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)表明,將AD和AA制備成脂質(zhì)體,或是將AA鍵合膽堿衍生物后,都可以顯著優(yōu)化藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),包括延長(zhǎng)生物消除半衰期,降低血液中的消除等。4.體內(nèi)抗瘧藥效學(xué)試驗(yàn)表明,ADLs的抗瘧作用具有濃度依賴性,其抗瘧效果優(yōu)于DHALS,AALS,AALS-CDLS和CDLS,