川丁特羅代謝機(jī)制及其對CYP450酶和P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體影響的體外評價研究川丁特羅,2-(4-氨基-3-氯-5-三氟甲基苯基)-2-叔丁氨基乙醇是我校藥物合成室合成的一個全新化合物,是一種新型的專一β2腎上腺素受體激動劑。臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,川丁特羅副作用少、作用時間長,藥效可持續(xù)12h左右,具有良好的應(yīng)用前景。本論文的主要目的在于研究川丁特羅的代謝機(jī)制,確定川丁特羅的主要代謝酶以及川丁特羅在大鼠體內(nèi)的主要代謝部位：研究川丁特羅對大鼠和人肝中主要代謝酶的抑制和誘導(dǎo)作用,評價其發(fā)生代謝性藥物相互作用的可能性；研究川丁特羅在Caco-2細(xì)胞模型上的轉(zhuǎn)運(yùn)行為及對P-糖蛋白(P-gp)的調(diào)控作用,評價其發(fā)生與轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)的藥物相互作用的可能性。1.川丁特羅體外代謝研究建立了測定大鼠S9組分中川丁特羅的HPLC法,并利用該法研究了川丁特羅在大鼠體內(nèi)的代謝部位。結(jié)果表明肝臟為川丁特羅在大鼠體內(nèi)代謝的主要組織,小腸也參與了川丁特羅在大鼠體內(nèi)的代謝。采用LC-MS/MS技術(shù),對川丁特羅在大鼠尿樣中的代謝物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)推斷,共發(fā)現(xiàn)9種代謝物(M1-M9),其中叔丁基羥基化后的葡萄糖醛酸結(jié)合物(M6)為新發(fā)現(xiàn)的代謝物。依照代謝物的質(zhì)譜響應(yīng),確定了川丁特羅在大鼠體內(nèi)的主要Ⅰ相代謝物為羰基化代謝物(M1)及叔丁基羥基化代謝物(M2)。采用CaCl2凝聚法制備了大鼠肝微粒體(RLM),建立了肝微粒體體外代謝研究模型。應(yīng)用LC-MS/MS技術(shù)對川丁特羅在RLM和人肝微粒體(HLM)中的代謝物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)推斷。結(jié)果顯示,川丁特羅在RLM和HLM中的代謝物種類相同,且除未檢測到苯環(huán)位置加O的代謝物M4外,肝微粒體代謝體系中的Ⅰ相代謝物與大鼠尿樣中的Ⅰ相代謝物種類相同,表明肝微粒體代謝體系可以模擬體內(nèi)Ⅰ相代謝,可用于川丁特羅代謝機(jī)制研究。2.川丁特羅羰基化代謝物(M1)和叔丁基羥基化代謝物(M2)代謝酶的確認(rèn)研究建立了測定HLM和重組酶中M1的UPLC-MS/MS法,并利用該法對川丁特羅經(jīng)HLM或人重組酶孵育后體系中的M1和M2分別進(jìn)行了定量和半定量分析。采用化學(xué)抑制劑法和重組酶法對參與生成M1和M2的CYP450酶進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,CYP2E1是催化生成M1的主要代謝酶；CYP2C19和CYP3A4/5是催化生成M2的主要代謝酶。3.川丁特羅對大鼠和人肝中主要CYP450酶活性的抑制作用和誘導(dǎo)作用研究建立了同時測定RLM及HLM中主要CYP450酶活性的LC-MS法,并利用該法研究了川丁特羅對大鼠CYP1A、CYP2C、CYP2D和CYP3A及人肝中CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4/5活性的影響。大鼠分別連續(xù)給予川丁特羅(0.3mg/kg、1.0mg/kg和3.0mg/kg)7天后,與對照組相比,未發(fā)現(xiàn)川丁特羅對大鼠CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP3A的活性有顯著影響,也未發(fā)現(xiàn)川丁特羅對大鼠肝重、RLM蛋白含量及CYP450含量有顯著影響。因此川丁特羅在藥動學(xué)劑量下不會對上述四類酶的活性產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用。川丁特羅對HLM中CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4/5的活性沒有抑制作用。原代人肝細(xì)胞經(jīng)川丁特羅誘導(dǎo)72h后,未發(fā)現(xiàn)川丁特羅對CYP1A2和CYP3A4/5活性有誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明川丁特羅在臨床用藥劑量下不會介導(dǎo)產(chǎn)生代謝性藥物相互作用。4.川丁特羅在Caco-2細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)及對P-糖蛋白(P-gp)的調(diào)控作用研究分別建立了測定轉(zhuǎn)運(yùn)液中川丁特羅及P-gp底物地高辛的UPLC-MS/MS法,并應(yīng)用該法研究了川丁特羅在Caco-2細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及對P-gp的調(diào)控作用。結(jié)果表明,川丁特羅的表觀滲透系數(shù)Papp>1×10-6cm/s,表明川丁特羅在小腸部位的吸收較好；其外排比率(EffluxRatio,ER)<1.5,表明川丁特羅主要通過被動擴(kuò)散進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。川丁特羅的ER值不受P-gp抑制劑維拉帕米和多藥耐藥蛋白1/2(MRP1/2)抑制劑MK-571的影響,川丁特羅不是P-gp和MRP1/2的底物。實(shí)驗(yàn)采用P-gp的經(jīng)典底物地高辛為探針?biāo)幬?研究了川丁特羅對Caco-2細(xì)胞中P-gp的