1柑橘衰退病毒基因型鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)室鑒定柑橘衰退病毒基因型本文件適用于柑橘類植物感染柑橘衰退病毒的RT-本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，3.2反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)ReverseTranscription-polymeraseChainReaction,RT-PCR4柑橘衰退病毒基因型信息根據(jù)柑橘衰退病毒外殼蛋白基因（Coatproteingene,CPG）內(nèi)的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物CPG-F/CPG-R，通過RT-PCR檢測(cè)樣品是否攜帶柑橘衰退病毒。然后利用柑橘衰退病2柑橘衰退病的田間癥狀具有一定的復(fù)雜性，根據(jù)指示植物表現(xiàn)的表型可分為3種癥狀SP）。其中苗黃型會(huì)引起幼苗的黃化，速衰型引起根系死亡，造成整個(gè)植株的快速死亡，田間以莖陷點(diǎn)型癥狀發(fā)生較為普遍，主要引起甜采集的樣品分別用樣品袋進(jìn)行分裝，放入適量樣品的記錄，將樣品記錄和樣品3d內(nèi)一并寄送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)接收樣品進(jìn)行登記編3每份樣品選取5片葉片。使用一次性刀片，切取葉片中部主脈及側(cè)脈部分，每份樣品），積異丙醇，并輕柔混勻，置于-20℃表1柑橘衰退病毒cDNA合成體系試劑（Reagent）每管用量（(Volume，μL）①10μmol/L隨機(jī)引物（6N）12.5mMdNTPs1模板RNA3②5×RTBuffer4RNA酶抑制劑（40U/μL）0.5反轉(zhuǎn)錄酶（5U/μL）1DEPCH2O4.5合計(jì)47.5.3反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：在PCR管中加入5μL的反轉(zhuǎn)錄混表2柑橘衰退病毒PCR擴(kuò)增體系試劑（Reagent）每管用量（(Volume，μL）10×PCRBuffer4.510μmol/L上游引物（F）0.510μmol/L下游引物（R）0.52.5mMdNTPs2r-TaqDNA聚合酶0.4cDNA1DEPCH2O合計(jì)257.5.5樣本柑橘衰退病毒PCR檢測(cè)的特待檢樣品核酸經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)電泳于凝膠成像系統(tǒng)觀察，凝膠上陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)一條大小為771bp的特異性條帶，陰性對(duì)照沒有任何擴(kuò)增條帶，表示檢測(cè)過程正常，5方可進(jìn)入下一步驟。待檢樣品若出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照相同大小的771bp特異性條帶，則判定該樣品為陽(yáng)性，即攜帶柑橘衰退病毒，若未出現(xiàn)771bp特異性條帶，則判定樣品為陰性，即（T36）、491bp（T68）特異性條帶，陰性對(duì)照沒有任何擴(kuò)增條帶，表示檢測(cè)過程正常，方可進(jìn)入下一步驟。待檢樣品若出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照相6（資料性）A.1柑橘衰退病癥狀注：B圖來自MorenoP,AmbrósS,Albiach-MartíMR,GuerriJ,Pe?aL.Citrustristezavirus:apathogenthatchangedthecourseofthecitrusindustry.MolPlantPathol.2008,9(2):251-268.7B.1柑橘衰退病毒基因型鑒定引物表3柑橘衰退病毒基因型鑒定引物信息VTF:GGAGTCGGACGGGCGGTR:ATARCAGTAACCGTCCTTCF:CTATTGATGTTGGTTATRACGTR:ACTGCGTTCGCTAGTGACAR:ACTGCGACGGAATGCTCTAR:TCTTGGGGACTTTCACGCF:ACAACGGT