1DNA條形碼鑒定茄屬種質(zhì)技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了DNA條形碼鑒定茄屬種質(zhì)的術(shù)語(yǔ)和定義、原理、儀器設(shè)備與主要試劑耗材、溶液配制、DNA條形碼引物、DNA條形碼序列、參照種質(zhì)、DNA條形碼序列的獲取和DNA條形碼比對(duì)及結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于茄屬種質(zhì)栽培茄（Solanummelongena）、水茄（S.和蒜芥茄（S.sisymbriifolium）DNA條形碼的測(cè)定、結(jié)果比對(duì)分析與判定。2術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。2.1待測(cè)種質(zhì)testedgermplasm待鑒定的疑似栽培茄、水茄、喀西茄或蒜芥茄種質(zhì)，由送檢人提供。2.2參照種質(zhì)referencegermplasm用于與待測(cè)種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段大小比較或DNA條形碼比對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)栽培茄、水茄、喀西茄或蒜芥茄種質(zhì)：贛茄1號(hào)、改良托魯巴姆、HC002和HC003（附錄4）。2.3DNA條形碼DNAbarcodeDNA條形碼是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段，DNA條形碼技術(shù)可用于鑒定物種及物種間親緣關(guān)系。matK：植物葉綠體中賴(lài)氨酸t(yī)RNA內(nèi)含子內(nèi)的成熟酶（參與RNA轉(zhuǎn)錄本中II型內(nèi)含子剪切）編碼基因。psbA-trnH：植物葉綠體psbA基因和trnH基因間的間隔序列。23方法原理根據(jù)茄屬種質(zhì)的matK或psbA-trnH序列特征，應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)茄屬種質(zhì)栽培茄、水茄、喀西茄或蒜芥茄進(jìn)行鑒定。4儀器設(shè)備與主要試劑耗材儀器設(shè)備及試劑、耗材參見(jiàn)附錄A。5溶液配制溶液配制方法參見(jiàn)附錄B。6DNA條形碼引物DNA條形碼引物相關(guān)信息見(jiàn)附錄C。7DNA條形碼序列DNA條形碼序列相關(guān)信息見(jiàn)附錄D。8參照種質(zhì)參照種質(zhì)參見(jiàn)附錄E。在進(jìn)行等位變異檢測(cè)時(shí)，應(yīng)同時(shí)包括相應(yīng)參照材料。9DNA條形碼序列的獲取9.1樣品準(zhǔn)備取0.2~0.5g待測(cè)種質(zhì)或參照種質(zhì)的植物組織置于2ml離心管中，做好標(biāo)記。9.2DNA提取9.2.1待測(cè)種質(zhì)和參照種質(zhì)采用改良CTAB法提取DNA，步驟如下：a）取直徑為6mm鋼珠2粒放入裝有樣品的2ml離心管中，加入預(yù)熱至65℃的CTAB溶液800μL，于植物組織研磨儀中充分研磨后，65℃水浴20min。b）取出離心管加入600μL氯仿/異戊醇（24：1）溶液后，上下顛倒混勻，10,000rpm離心10min。3c）取上清液400μL于新的1.5ml離心管，加入800μL無(wú)水乙醇并混勻，10,000rpm離心10min。d）去上清液，加入75%無(wú)水乙醇，顛倒混勻后于10,000rpm離心2min，棄上清，自然晾干后加50μLddH2O溶解DNA。e）用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，用ddH2O將DNA稀釋到100ng/μL，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2若待測(cè)種質(zhì)樣本量少，或樣本已降解或部分降解，可購(gòu)買(mǎi)專(zhuān)用試劑盒提取DNA，按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行提取，并按照9.2.1步驟e）的方法存放。9.3PCR擴(kuò)增9.3.1PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系為：2×TaqMasterMix（含染料）20μL，10μM正向引物（附錄C表C.1）和反向引物（附錄C表C.1）各0.4μL，100ng/μL的DNA模板2.0μL，ddH2O補(bǔ)齊至40μL。每管PCR體系滴入一滴液體石蠟防止蒸發(fā)。9.3.2PCR反應(yīng)程序所述PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，38個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。9.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)9.4.1凝膠制備稱(chēng)取1.2g瓊脂糖于三角瓶中，加入120ml1×TAE緩沖液，在微波爐中加熱至完全溶解后自然冷卻至約50℃,加入12μL核酸凝膠染色試劑GelRed（10,000×水溶液），混勻后倒于放有凝膠托盤(pán)的制膠盒中，垂直將加樣梳插入制膠盒的小凹槽中。9.4.2電泳及檢測(cè)瓊脂糖膠凝固后，垂直撥出加樣梳，將凝膠托盤(pán)取出置于電泳槽中，用移液器吸取5μLDL2000Marker點(diǎn)于每排第一個(gè)加樣孔，其后依次加入4μL待檢測(cè)PCR產(chǎn)物。將電泳儀設(shè)置為恒壓150V，待指示染料遷移至凝膠2/3處時(shí)，取出于凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)PCR條帶。參照種質(zhì)的matK片段大小為1032bp，psbA-trnH片段大小為745bp，待測(cè)樣品條帶大小應(yīng)與參照種質(zhì)條帶大小基本一致，對(duì)待測(cè)樣品PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，獲取DNA條形碼序列。10DNA條形碼比對(duì)及結(jié)果判定4將疑似栽培茄待測(cè)種質(zhì)matK片段兩端質(zhì)量低的DNA序列截去后，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)（/Blast.cgi相似度最高的為栽培茄；與序列1（附錄D.1）進(jìn)行比對(duì)，對(duì)應(yīng)序列1的第491位堿基為C，同時(shí)第726位堿基為T(mén)，則確定待測(cè)種質(zhì)為栽培茄。將疑似水茄待測(cè)種質(zhì)matK片段兩端質(zhì)量低的DNA序列截去后，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，相似度最高的為水茄；與序列1（附錄D.1）進(jìn)行比對(duì)，對(duì)應(yīng)序列1的第682位堿基為T(mén)，則確定待測(cè)種質(zhì)為水茄。將疑似喀西茄待測(cè)種質(zhì)psbA-trnH片段兩端質(zhì)量低的DNA序列截去后，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，相似度最高的為喀西茄；與序列2（附錄D.2）進(jìn)行比對(duì)，對(duì)應(yīng)序列2的第232位堿基為A，則確定待測(cè)種質(zhì)為喀西茄。將疑似蒜芥茄待測(cè)種質(zhì)matK片段兩端質(zhì)量低的DNA序列截去后，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，相似度最高的為蒜芥茄；與序列1（附錄D.1）進(jìn)行比對(duì)，對(duì)應(yīng)序列1的第645位堿基為C，則確定待測(cè)種質(zhì)為蒜芥茄。（資料性附錄）主要儀器設(shè)備與試劑、耗材A.1主要儀器設(shè)備A.1.2純水儀。電子天平。磁力攪拌器。恒溫水浴鍋。高速離心機(jī)。A.1.8超微量分光光度計(jì)。A.1.9PCR儀。A.1.10微波爐。A.1.12凝膠成像系統(tǒng)。A.1.13冰箱。A.2主要試劑A.2.1十六烷基三乙基溴化銨（CTAB，AR）。A.2.2聚乙烯吡咯烷酮K-30（PVPK-30，AR）。A.2.3乙二銨四乙酸二鈉（Na2EDTA，AR）。A.2.4二水乙二銨四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O，AR）。A.2.5冰乙酸（CH3COOH，AR）。A.2.6氯化鈉（NaCl，AR）。A.2.7三羥甲基氨基甲烷（Tris堿，AR）。A.2.8氯仿（CHCl3，AR）。A.2.9異戊醇（C5H12O，AR）。A.2.10無(wú)水乙醇（C?H?O，AR）。A.2.11氫氧化鈉（NaOH，AR）。A.2.122×TaqMasterMix。A.2.13DNAMarker（DL2000）。A.2.14液體石蠟（AR）。A.2.15DNA條形碼引物。A.2.16ddH2O。A.3主要耗材A.3.1離心管（1.5ml，2.0ml）。A.3.2移液器及配套槍頭。A.3.3槍頭盒。A.3.4A.3.5藍(lán)蓋試劑瓶。A.3.6A.3.7一次性手套。A.3.8乳膠手套。A.3.9量筒。A.3.10玻璃棒。A.3.11三角瓶。A.3.12制膠盒A.3.13凝膠托盤(pán)A.3.14加樣梳。7（規(guī)范性附錄）溶液配制B.1DNA提取液的配制稱(chēng)取Tris-HCl12.44g，NaCl81.82g，Na2EDTA7.45g，CTAB20g，PVPK-3020g，加ddH2O至800ml刻度處，于65℃加熱使其充分溶解，待溶液冷卻至室溫后用NaOH將pH調(diào)至8.0。B.1.2氯仿/異戊醇（24:1）溶液量取480ml氯仿，20ml異戊醇置于棕色玻璃瓶中，混勻備用。B.1.375%無(wú)水乙醇量取375ml無(wú)水乙醇，125mlddH2O于棕色玻璃瓶中，混勻備用。B.2PCR擴(kuò)增溶液的配制B.2.1DNA條形碼引物稀釋裝有引物（見(jiàn)附錄C）粉末的離心管在離心機(jī)中5000r/min離心2min，加適量ddH2O將引物稀釋B.3瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)溶液的配制B.3.150×TAE緩沖液稱(chēng)取Tris堿242g，Na2EDTA·2H2O37.2g，加ddH2O至800ml刻度處，攪拌混勻，加入57.1ml冰乙酸，加ddH2O定容至1000ml。（規(guī)范性附錄）DNA條形碼引物見(jiàn)表C.1表C.1DNA條形碼引物編號(hào)目標(biāo)DNA條形碼引物序列(5'→3')1matKF:ACAAAAAATATCCAAATACCAAATCCR:CCCGTTCATCTGGAAATCTTG2psbA-trnHF:ATCCACTTGGCTACATCCGCR:CAACAACTCTCGTTCGTTACACTTC（資料性附錄）D.1matK序列acaaaaaatatccaaataccaaatccgacttctatatactccccacaaatcgtgggaaggtcaaagaaagaacttgttcttccgacgttaagaattcttccaatcgagcccgatcttttcaaaaaagtgcgtacagtacttttgtgtttccgagagcacaagaaagtcgaagtatatactttattcgatataaagtcttttttgctataataatgaaaaagatttctgcatatacgcccaaatcggtcaataatgataaatcggaccaaactggtttactaatgggatgccctaatacggtacaaatttagctaatgatccaatcaaaggaataattggaacaagggtctcgaacttcttattattgattagaaatgaattttctaacatttgactacgtaccattgaacacacttgaaagatagccc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