2茶葉中蔗糖的檢測方法本文件規(guī)定了使用高效液相色譜儀測定茶葉中蔗糖的方法。本文件適用于茶葉中蔗糖含量的測定。第一法適用于蔗糖含量大于等于0.075g/100g的試樣，第二法適用于蔗糖含量大于等于1.5g/100g的試樣。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682GB/T8302GB/T8303分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法茶取樣茶磨碎試樣的制備及其干物質含量測定3原理試樣用乙酸乙酯提取，去除蠟質、色素等干擾成分后，再用水提取蔗糖。提取液經(jīng)固相萃取柱凈化，去除茶多酚、色素等干擾成分后，用高效液相色譜儀分離，蒸發(fā)光檢測器檢測，外標法定量。4試劑和材料除非另有說明，本方法所用的試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。4.1試劑4.1.1乙腈（CH3CN，CAS號：75-05-8）：色譜純。4.1.2乙酸乙酯（C4H8O2，CAS號：14-78-6）。4.2材料4.2.1微孔濾膜：0.45μm，水相。4.2.2茶葉專用凈化小柱：NPP，200mg/2.5mL。注：NPP凈化小柱是北京科德諾思技術有限公司的商品型號，給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不是表4.3標準品蔗糖（C12H22O11，CAS號：57-50-1純度≥99%，或經(jīng)國家認證并授予標準物質證書的標準物質。4.4標準溶液配制4.4.1標準儲備液（20.0mg/mL）：稱取經(jīng)過96℃±2℃干燥至恒重的蔗糖1g（精確到0.0001g），用水定容至50mL，密封置于4℃下可貯藏1個月。4.4.2標準中間液（1.00mg/mL準確吸取儲備液0.500mL于10mL容量瓶中，用水定容。（臨用時現(xiàn)配）4.4.3標準使用液A：分別準確吸取蔗糖標準儲備液（4.4.1）0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL于310mL容量瓶中，用水定容。該系列標準使用液的濃度分別為：1.00mg/mL、2.00mg/mL、5.00mg/mL、10.0mg/mL。（臨用時現(xiàn)配）4.4.4標準使用液B：分別準確吸取標準中間液（4.4.2）0.50mL、2.00mL、5.00mL于10mL容量瓶中，用水定容。該系列標準使用液的濃度分別為：0.0500mg/mL、0.200mg/mL、0.500mg/mL。（臨用時現(xiàn)配）5儀器和設備5.1分析天平：感量為0.001g和0.0001g。5.2超聲波振蕩器。5.3離心機：轉速≥4000r/min。5.4液相色譜儀：配備蒸發(fā)光散射檢測器。5.5粉碎機：粉碎細度40目～200目。6試樣制備和保存6.1取樣按照GB/T8302的規(guī)定執(zhí)行。6.2試樣制備和保存6.2.1緊壓茶以外的各類茶：試樣用粉碎機粉碎，過300μm的標準網(wǎng)篩,篩上少量茶梗，棄去。篩下試樣常溫密閉避光保存。6.2.2緊壓茶：用錘子和鑿子將緊壓茶分成4份～8份，在每份不同處取樣?；蛴秒娿@在緊壓茶上均勻鉆孔9個～12個，將所有取下來的試樣混合后粉碎。余下步驟同6.2.1。7分析步驟7.1干物質含量測定按GB/T8303的規(guī)定執(zhí)行。7.2樣品處理7.2.1樣品提取稱取混勻試樣約2g（精確到0.001g）于50mL離心管中，加入10mL乙酸乙酯，搖勻，于超聲波振蕩器上超聲提取5min，于4000r/min下離心5min。用吸管吸取上清液，棄去。余下茶渣用適量水轉入50mL容量瓶，超聲提取5min，冷卻至室溫用水定容至刻線。搖勻后靜置，上清液備用。7.2.2凈化將茶葉專用凈化小柱（4.2.2）下接0.45μm水相微孔濾膜，吸取樣品提取液（7.2.1）樣液約1mL，過柱，控制流速約1滴/秒，收集凈化液于進樣瓶中，上機測定。茶葉專用凈化小柱操作示意圖見附錄B中的圖B。7.3液相色譜儀參考條件7.3.1液相色譜柱：PolyaminoHILIC色譜柱（柱長250mm，內徑4.6mm，粒徑5μm），或具有同等性能者。7.3.2流動相：A為水，B為乙腈；梯度洗脫程序見表1。7.3.3流速：1.0mL/min。7.3.4柱溫：40℃。7.3.5進樣量：10μL。7.3.6蒸發(fā)光檢測器條件：漂移管溫度70~80）℃;氮氣壓力：350kPa。表1蒸發(fā)光散射檢測器法梯度洗脫程序4087.4標準曲線的制作根據(jù)所使用液相色譜儀的響應情況，在標準使用液A（4.4.3）和標準使用液B（4.4.4）中選取5個合適水平的標準使用液，按濃度由低到高的順序依次上液相色譜儀測定，記錄蔗糖峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積的對數(shù)為縱坐標，繪制標準曲線。液相色譜圖見附錄A中的圖A.1。7.5樣品測定將待測樣液注入液相色譜儀中，得到待測溶液中蔗糖的峰面積，根據(jù)標準曲線得到樣液中蔗糖的濃度。待測樣液中蔗糖的響應值應在標準曲線的線性范圍內，超過線性范圍需調整稱樣量重新分析。7.6空白實驗除不加試樣外，均按上述步驟進行。8分析結果的表述試樣中蔗糖含量按式（1）計算：式中：X——試樣中蔗糖含量，單位為克每百克（g/100g）；ρ——試樣溶液中蔗糖濃度，單位為毫克每毫升（mg/mL）；0——空白溶液中蔗糖濃度，單位為毫克每毫升（mg/mL）；V——樣液定容體積，單位為毫升（mL）；100——換算系數(shù)；m——試樣質量，單位為克（g）；1000——換算系數(shù)；ω——茶葉中干物質含量（質量分數(shù)），%。當測量結果大于1（g/100g）時保留到小數(shù)點后2位。當測量結果小于1（g/100g）時保留到小數(shù)點后3位。9重復性和再現(xiàn)性在重復性條件下，獲得兩次獨立測試結果的相對偏差不得超過重復性限（r）7%。在再現(xiàn)性條件下，獲得兩次獨立測試結果的相對偏差不得超過再現(xiàn)性限（R）15%。10檢出限和定量限當稱樣量為2g，采用蒸發(fā)光散射檢測器法時，檢出限和定量限分別為0.025g/100g和0.075g/100g。511原理試樣用乙酸乙酯提取，去除蠟質、色素等干擾成分后，再用水提取蔗糖。提取液經(jīng)固相萃取柱凈化，去除茶多酚、色素等干擾成分后，用高效液相色譜儀分離，示差檢測器檢測，外標法定量。12試劑和材料12.1試劑12.2材料12.3標準品12.4標準溶液配制12.4.1蔗糖標準儲備液（20.0mg/L）：同4.4.1。12.4.2蔗糖標準使用液：分別吸取蔗糖標準儲備液0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、5.00mL于（臨用時現(xiàn)配）13儀器和設備液相色譜儀：配備示差檢測器。其它同5。14試樣制備和保存14.1取樣14.2試樣制備和保存15分析步驟15.1干物質含量測定15.2樣品提取15.3凈化15.4液相色譜參考條件15.4.2流動相：乙腈:水=70:30（體積比），預混流動相，單泵進樣。15.4.3流速：1.0mL/min。15.4.4柱溫：35℃。15.4.5進樣量：10μL。615.4.6示差檢測器溫度：35℃。16標準曲線的制作將蔗糖標準使用液（12.4.2）按濃度由低到高的順序依次上液相色譜儀測定，記錄蔗糖峰面積，以蔗糖濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。液相色譜圖見附錄A中的圖A.2。17樣品測定18空白實驗除不加試樣外，均按樣品測定步驟進行。19分析結果的表述20重復性和再現(xiàn)性在重復性和再現(xiàn)性條件下，兩次獨立測試結果的相對偏差應符合下表要求：表2重復性和再現(xiàn)性要求21檢出限和定量限當稱樣量為2g，蔗糖的檢出限和定量限分別為0.5g/100g和1.5g/100g。附錄A參考液相色譜圖A.1蔗糖標準物質的蒸發(fā)光散