川芎基于抗血小板聚集作用與藥效成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)中藥川芎來(lái)源于傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖,具有“活血行氣,祛風(fēng)止痛”之功效。傳統(tǒng)鑒別經(jīng)驗(yàn)以“個(gè)大、飽滿(mǎn)、質(zhì)堅(jiān)實(shí)、斷面黃白色、油性大、香氣濃者”為佳。在2015年版《中國(guó)藥典》中,川芎以乙醇提取物(12%)和阿魏酸的含量(0.1%)為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。顯然,這兩項(xiàng)指標(biāo)難以有效地評(píng)價(jià)川芎的質(zhì)量。現(xiàn)代研究表明,抗血小板聚集能夠反映川芎活血化瘀的功效。川芎的主要藥效成分(阿魏酸松柏酯、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A等)大多數(shù)為油狀物,不穩(wěn)定,難標(biāo)化。為此,本論文建立以歐當(dāng)歸內(nèi)酯A為內(nèi)參物的川芎一測(cè)多評(píng)法和抗血小板聚集作用的生物檢定法,對(duì)川芎的藥效成分和抗血小板聚集活性進(jìn)行比較,以期為川芎的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。研究?jī)?nèi)容包括以下三部分:第一、川芎抗血小板聚集作用的定量測(cè)定:(1)通過(guò)考察體外定量測(cè)定抗血小板聚集作用的各個(gè)影響因素,建立了定量測(cè)定川芎抗血小板聚集作用的方法,即家兔血液經(jīng)800rpm二次離心(每次10min)得到富血小板血漿(PRP),經(jīng)3500rpm離心得到貧血小板血漿(PPP);加入300μmol/LADP的誘導(dǎo)血小板聚集,供試品溶解加入15%助溶劑二甲基亞砜(DMSO),從取血到測(cè)定血小板聚集率的整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作在3h內(nèi)完成。以阿魏酸鈉為陽(yáng)性藥,在15~60mg/mL濃度范圍內(nèi)與血小板抑制率呈良好的線(xiàn)性關(guān)系(r=0.9934,n=4)。川芎粉末用水提取4次,以水溶液為供試液,根據(jù)量反應(yīng)平行線(xiàn)法(2.2)法,測(cè)定次數(shù)不少于4次,可靠性檢測(cè)(回歸項(xiàng)P值<0.01,偏離平行項(xiàng)P>0.05)滿(mǎn)足《藥典》的要求,重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)RSD值為3.43%(n=6),精密度實(shí)驗(yàn)的RSD值為6.98%(n=6),可信限率為23.90%(n=6),小于30%。說(shuō)明該方法的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性良好。(2)從不同產(chǎn)地和藥材市場(chǎng)、飲片公司和藥店收集了13份川芎藥材樣品、2份川芎飲片(川芎飲片和酒炙飲片)、2份川芎相關(guān)的中成藥(速效救心丸和樂(lè)脈顆粒),測(cè)定其抗血小板聚集活性。結(jié)果表明,川芎藥材、飲片及其相關(guān)中成藥的抗血小板聚集活性分別為0.957U/g(n=13)、0.713(n=2)、0.646(n=2),說(shuō)明建立的方法可以測(cè)定川芎藥材、飲片及其相關(guān)中成藥的抗血小板聚集活性。(3)根據(jù)川芎氣味,斷面顏色,將13份川芎藥材中的10份樣品分為一、二、三等:一等品香氣濃郁、斷面黃白色;二等品香氣濃郁、斷面黃色;三等品香氣較淡、斷面黃褐色。測(cè)定其抗血小板聚集活性,分別為1.306U/g(n=4,一等)、0.914U/g(n=3,二等)、0.722U/g(n=3,三等)。表明川芎抗血小板聚集活性的強(qiáng)弱與其氣味、斷面顏色的相關(guān)性強(qiáng)。第二、一測(cè)多評(píng)法測(cè)定川芎藥材中7種藥效成分的含量:(1)通過(guò)優(yōu)化色譜條件,考察一測(cè)多評(píng)法的相關(guān)影響因素,建立了以歐當(dāng)歸內(nèi)酯A為內(nèi)參物測(cè)定阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、H、A、魏酸松柏酯、Z-藁本內(nèi)酯和歐當(dāng)歸內(nèi)酯A共7種藥效成分的方法。歐當(dāng)歸內(nèi)酯A與其他6種藥效成分的相對(duì)校正因子分別為1.14、1.46、1.44、0.54、0.30、0.81。通過(guò)在3臺(tái)色譜系統(tǒng)、2種色譜柱、3種流速和3種柱溫條件下測(cè)定的相對(duì)校正因子的RSD值均小于5%,表明方法的重現(xiàn)性良好。42份川芎樣品經(jīng)外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法測(cè)定6種藥效成分(阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、H、A、阿魏酸松柏酯、Z-藁本內(nèi)酯)含量的RSD值均小于5%,表明建立一測(cè)多評(píng)法可準(zhǔn)確地測(cè)定川芎中這7種藥效成分的含量。(2)從不同產(chǎn)地和藥材市場(chǎng)收集了44份川芎藥材樣品,根據(jù)藥材的氣味和斷面顏色分為三個(gè)等級(jí)。測(cè)定其7種藥效成分含量,并計(jì)算主成分分析的綜合得分。結(jié)果表明,一、二等品之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),一、二等品與三等品之間有極顯著性差異(P<0.01),且一等品(﹣15.192,n=7)、二等品(﹣17.290,n=25)>三等品(﹣7.062,n=10);系統(tǒng)聚類(lèi)分析可以將三等品與一、二等品分開(kāi),但一、二等品之間無(wú)法分開(kāi)。分別以酚酸類(lèi)成分、苯酞類(lèi)成分、酚酸類(lèi)和苯酞類(lèi)成分總和的含量為指標(biāo),一、二等品之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),一、二等品與三等品之間有極顯著性差異(P<0.01),且一、二等品>三等品。以單一藥效成分的含量為指標(biāo),Z-藁本內(nèi)酯的含量與不同等級(jí)川芎藥材呈正相關(guān),一、二、三等品之間有極顯著性差異(P<0.01),即一等品(13.492mg/g,n=7)>二等品(9.899mg/g,n=25)>三等品(5.818mg/g,n=9)。(3)從不同產(chǎn)地收集了31份川芎藥材(四川都江堰7份,四川彭州13份、四川眉山11份),測(cè)定7個(gè)藥效成分的含量。根據(jù)主成分分析的綜合得分結(jié)果表明,四川彭州(6.11,n=13)>四川眉山(5.44,n=11)>四川都江堰(5.28,n=7);經(jīng)方差分析結(jié)果表明,四川眉山與四川都江堰之間沒(méi)有差異(P>0.05),四川眉山、四川都江堰與彭州之間有差異(P<0.01),即四川彭州>四川都江堰和四川眉山。酚酸類(lèi)成分、苯酞類(lèi)成分、酚酸類(lèi)和苯酞類(lèi)成分總和的含量在3個(gè)產(chǎn)地之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05);以單一藥效成分含量為指標(biāo),Z-藁本內(nèi)酯的含量在四川都江堰與四川彭州之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),而在四川都江堰、四川彭州與四川眉山之間有極顯著性差異(P<0.01);洋川芎內(nèi)酯A的含量在四川彭州與四川眉山之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),在四川彭州、四川眉山與四川都江堰之間有極顯著性差異(P<0.01);其余的藥效成分的含量在這3個(gè)產(chǎn)地的樣品之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。說(shuō)明不同產(chǎn)地川芎藥材Z-藁本內(nèi)酯和洋川芎內(nèi)酯A的含量不同。第三、川芎藥效成分與抗血小板聚集活性之間的相關(guān)性研究:(1)建立了川芎經(jīng)不同濃度(100%、70%、50%、30%、0)乙醇提取的提取物的HPLC指紋圖譜,根據(jù)對(duì)照品的保留時(shí)間和紫外光譜,鑒定了9個(gè)色譜峰,分別為阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞,歐當(dāng)歸內(nèi)酯A。經(jīng)灰色關(guān)聯(lián)度分析,這9種藥效成分與抗血小板聚集活性的關(guān)聯(lián)系數(shù)從大到小依次為0.6492(E-藁本內(nèi)酯)、0.6316(洋川芎內(nèi)酯H)、0.6198(阿魏酸)、0.6163(洋川芎內(nèi)酯I)、0.6101(阿魏酸松柏酯)、0.6071(洋川芎內(nèi)酯A)、0.5588(丁烯基苯酞)、0.5703(Z-藁本內(nèi)酯)、0.5230(歐當(dāng)歸內(nèi)酯A)。說(shuō)明這9種藥效成分與抗血小板聚集活性之間的相關(guān)性相近。苯酞類(lèi)和酚酸類(lèi)成分之和、酚酸類(lèi)成分、苯酞類(lèi)成分與抗血小板聚集活性之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)分別為0.6105、0.6099和0.6098,說(shuō)明這幾類(lèi)成分與抗血小板聚集活性之間的相關(guān)性也相近。(2)測(cè)定了川芎藥材水提物中的藥效成分(阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、H、A)的含量,對(duì)不同等級(jí)川芎水提取物中的藥效成分含量與其抗血小板聚集作用的生物效價(jià)進(jìn)行曲線(xiàn)估計(jì),只有阿魏酸與川芎水提物的抗血小板聚集活性的曲線(xiàn)估計(jì)通過(guò)t檢驗(yàn),呈現(xiàn)S形變化