如何分離鑒定氨基酸混合液？生物化學與分子生物學實驗教學中心氨基酸的薄層層析

(Thinlayerchromatographyofaminoacids)

生物化學與分子生物學實驗教學中心實驗目的掌握薄層層析法的一般原理。掌握氨基酸薄層層析法的基本操作技術。掌握如何根據移動速率（Rf值）來鑒定被分離的物質（即氨基酸混合液）。09年秋季學期生物化學與分子生物學實驗教學中心層析技術概念：是利用化合物中各組分的物理性質的差別（如溶解度、吸附能力、分子形狀和大小、分子極性等）使各組分在兩相中的分布不同，從而使各組分以不同速度隨流動相向前移動而達到分離的目的。特點：分離效率高，能分離各種性質相類似的物質。不僅可用于少量物質的分離純分，也可用于大量物質的分離純化和制備。09年秋季學期生物化學與分子生物學實驗教學中心層析的基本過程組分A組分B+流動相固定相吸附溶解結合等解除上述作用反復進行組分A組分B移動速度不同09年秋季學期生物化學與分子生物學實驗教學中心層析法的分類氣相層析（以氣體為流動相的層析法）液相層析（以液體為流動相的層析法，此為生物化學領域里常用的方法）

1.吸附層析：薄層吸附層析、吸附柱層析

2.分配層析：紙層析、柱層析、薄層層析3.離子交換層析4.凝膠層析：柱層析、薄膜層析5.親和層析

09年秋季學期生物化學與分子生物學實驗教學中心茚三酮反應(ninhydrinreaction)09年秋季學期生物化學與分子生物學實驗教學中心實驗原理3.混合氨基酸被分離后在薄層層析圖譜上的位置用相對遷移率—Rf值（rateofflow）來表示。層析中，物質沿溶劑運動方向遷移的距離與溶液前沿的距離之比為Rf值。由于物質在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故移動速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根據Rf值來鑒定被分離的物質。09年秋季學期生物化學與分子生物學實驗教學中心實驗材料吸附劑：硅膠粘合劑：

0.5%的羧甲基纖維素鈉氨基酸的異丙醇溶液丙氨酸、精氨酸、甘氨酸展開-顯色劑（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）分析樣品：氨基酸混合液09年秋季學期生物化學與分子生物學實驗教學中心器材層析板、尺子、鉛筆燒杯、量筒噴霧器、吹風機毛細管、層析缸藥匙烘烤箱09年秋季學期生物化學與分子生物學實驗教學中心操作步驟—

薄層板的制備

1、調漿稱取硅膠3克，加0.5%的羧甲基纖維素鈉8毫升，調成均勻的糊狀。

2、涂布取潔凈的干燥玻璃板均勻涂層。

3、干燥將玻璃板水平放置，室溫下自然涼干。

4、活化70℃烘干30分鐘。切斷電源，待玻璃板面溫度下降至不燙手時取出。09年秋季學期生物化學與分子生物學實驗教學中心操作步驟—

點樣2cm1cm1、位置：用鉛筆距底邊2cm水平線上均勻確定4個點。每個樣品間相距1cm。2、用毛細管分別吸取氨基酸溶液，輕輕接觸薄層表面點樣。3、加樣后原點擴散直徑不超過2mm。4、待點樣點干后再重復點一次。AlaArgGlyMix09年秋季學期生物化學與分子生物學實驗教學中心操作步驟—展層、顯色將薄層板點樣端浸入展層-顯色劑，展層-顯色劑液面應低于點樣線。蓋好層析缸蓋，上行展層。當展層劑前沿離薄板頂端2cm時，停止展層，取出薄板，用鉛筆描出溶劑前沿界線，用熱風吹干或在85℃下烘干，即可顯出各層斑點。AlaArgGlyMix09年秋季學期生物化學與分子生物學實驗教學中心注意事項1.切勿用手直接接觸薄層板面。2.點樣過程中必須在第一滴樣品干后再點第二滴。3.樣品量太少，有的成分不易顯示；樣品量太多，易造成斑點過大，互相交叉或拖尾。09年秋季學期生物化學與分子生物學實驗教學中心Rf=斑點至原點距離溶劑前緣至原點距離結果計算小心量出斑點中心至原點中心距離，再量出原點中心至溶劑前沿的距離，計算出它們的Ｒｆ值。

根據Ｒｆ值，鑒定出混合樣品中氨基酸的種類，并繪出層析圖譜。09年秋季學期生物化學與分子生物學實驗教學中心