仿刺參銅鋅超氧化物歧化酶（Aj-SOD1）的功能及性質(zhì)分析超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,簡(jiǎn)稱SOD1)是生物體內(nèi)一種重要的金屬酶,對(duì)機(jī)體有高效的抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)主要研究仿刺參銅鋅超氧化物歧化酶的功能及性質(zhì)。通過(guò)生物信息學(xué)分析方法,對(duì)Aj-SOD1理論蛋白等電點(diǎn)及蛋白分子質(zhì)量進(jìn)行預(yù)測(cè)(pI=5.65,MW=15.47kDa)。利用MAGA6.0構(gòu)建了Aj-SOD1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用SwissModel分析蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示目的蛋白能夠結(jié)合銅、鋅離子。利用熒光定量PCR,對(duì)Aj-SOD1基因的分布表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明,發(fā)現(xiàn)Aj-SOD1在各組織都有相應(yīng)的表達(dá),但在腸和呼吸樹(shù)中表達(dá)顯著。實(shí)驗(yàn)首先對(duì)海參的體腔細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng),構(gòu)建H202/LPS的細(xì)胞培養(yǎng)模型,對(duì)經(jīng)H202/LPS刺激細(xì)胞的情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明,在H202/LPS刺激過(guò)程中,海參體腔細(xì)胞出現(xiàn)了明顯凋亡損傷作用。實(shí)驗(yàn)同時(shí)研究了Aj-SOD1蛋白對(duì)細(xì)胞具有一定的抗氧化作用,并對(duì)經(jīng)H202/LPS刺激損傷細(xì)胞的修復(fù)功能。本實(shí)驗(yàn)克隆了(Aj-SOD1)cDNA全長(zhǎng)編碼序列基因。利用TRIZOL法從海參腸組織中提取總RNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增獲得Aj-SOD1基因的編碼序列(GenBank:JX097096.1,459bp)。構(gòu)建克隆載體pMD18-Aj-SOD1。在目的基因兩端引入XhoI/NdeⅠ酶切位點(diǎn),及His標(biāo)簽后,將Aj-SOD1克隆質(zhì)粒與表達(dá)載體pET30a(+)分別雙酶切后連接,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET30a-Aj-SOD1。將含有pET30a-SOD1重組子轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。成功構(gòu)建Aj-SOD1的原核表達(dá)載體。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,實(shí)驗(yàn)利用Ni-NTA親和層析,獲得了純度高、可溶、具有抗氧化活性的海參SOD1蛋白。最后實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了蛋白表達(dá)的條件,獲得了最優(yōu)表達(dá)條件,溫度37℃,誘導(dǎo)時(shí)間8h,轉(zhuǎn)速設(shè)置為200r/min,誘導(dǎo)劑濃度0.1mM。本實(shí)驗(yàn)對(duì)