第四章DNA的復(fù)制

Chapter4DNAReplication整理課件第四章DNA復(fù)制

DNAReplication1引言---基因組復(fù)制與細(xì)胞分裂的關(guān)系2復(fù)制子3DNA復(fù)制的幾種形式4DNA聚合酶5原核生物DNA復(fù)制的根本過程6真核生物DNA復(fù)制7DNA復(fù)制的調(diào)控8小結(jié)整理課件重點(diǎn)內(nèi)容：①幾個(gè)重要概念：DNA的復(fù)制、復(fù)制子、復(fù)制眼、復(fù)制叉、DNA聚合酶、DNA的半保存復(fù)制、DNA的半不連續(xù)復(fù)制、DNA的先導(dǎo)鏈、DNA的后隨鏈、岡崎片段；②不同生物基因組復(fù)制子數(shù)目；③線性DNA復(fù)制末端問題的提出及解決方案；④θ-復(fù)制、滾環(huán)復(fù)制及D-環(huán)復(fù)制的機(jī)制；⑤大腸桿菌DNA聚合酶I、II、III的性質(zhì)比較，DNA聚合酶Ⅰ與缺口平移法制備探針；⑥D(zhuǎn)NA復(fù)制的起始、延伸及終止。了解內(nèi)容：①基因組復(fù)制與細(xì)胞分裂的關(guān)系；②復(fù)制叉移動(dòng)方向確實(shí)定；真核生物DNA聚合酶的種類及各自的功能；③DNA復(fù)制的調(diào)控。整理課件1引言---基因組復(fù)制與細(xì)胞分裂的關(guān)系細(xì)胞在每次分裂的過程中，整個(gè)基因組都必須精確地復(fù)制一次。如何保證這一點(diǎn)？兩個(gè)原那么(1)DNA復(fù)制的啟動(dòng)決定了細(xì)胞的進(jìn)一步分裂;(2)復(fù)制過程完成前，細(xì)胞是不會(huì)發(fā)生分裂的。整理課件2復(fù)制子(replicon)2.1復(fù)制子的定義2.2不同生物復(fù)制子的數(shù)目2.3復(fù)制眼概念2.4復(fù)制叉概念及其移動(dòng)方向的實(shí)驗(yàn)確定2.5復(fù)制的模式---起點(diǎn)、方向和速度整理課件2.1復(fù)制子的定義DNA中發(fā)生一次復(fù)制的單位稱為復(fù)制子(replicon)。復(fù)制子是根據(jù)它含有復(fù)制所需的控制元件來定義的，在復(fù)制啟動(dòng)位點(diǎn)具起始點(diǎn)〔origin)，在復(fù)制終止位點(diǎn)具終點(diǎn)〔terminus)。起始點(diǎn)僅作用于所在復(fù)制子。注：在每個(gè)細(xì)胞周期中，每個(gè)復(fù)制子發(fā)生一次復(fù)制，且只發(fā)生一次。整理課件質(zhì)粒一般是一個(gè)自主環(huán)狀的DNA基因組，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立復(fù)制子；原核生物基因組中一般只含一個(gè)復(fù)制子，在唯一的起始點(diǎn)啟動(dòng)就會(huì)引起整個(gè)基因組復(fù)制；真核生物基因組含多個(gè)復(fù)制子〔一般40-100kb/個(gè)〕。

2.2不同生物復(fù)制子的數(shù)目整理課件2.3復(fù)制眼概念

復(fù)制眼：在一個(gè)長的未復(fù)制區(qū)域內(nèi)DNA已經(jīng)復(fù)制的區(qū)域整理課件Replicationeye整理課件復(fù)制叉:雙螺旋DNA兩條親本鏈分開使復(fù)制能進(jìn)行的部位。2.4復(fù)制叉的概念及其移動(dòng)方向確實(shí)定整理課件復(fù)制叉移動(dòng)方向確實(shí)定放射性自顯影法：對于大基因組內(nèi)的不確定區(qū)域，兩次連續(xù)的放射脈沖可以用來標(biāo)記復(fù)制的移動(dòng)。如果一個(gè)脈沖比另一個(gè)脈沖強(qiáng)，我們可以用相對的標(biāo)記強(qiáng)度來區(qū)分，這些可用放射自顯影觀察。單向復(fù)制：在復(fù)制眼的一端，一種類型的標(biāo)記后緊跟著另一種標(biāo)記；雙向復(fù)制：在復(fù)制眼的兩端產(chǎn)生一種〔對稱的〕模式。在真核生物中普遍存在。整理課件2.5復(fù)制的模式---起點(diǎn)、方向和速度單起點(diǎn)、單方向多起點(diǎn)、單方向單起點(diǎn)、雙方向多起點(diǎn)、雙方向整理課件3DNA復(fù)制的幾種形式3.1線性DNA雙鏈的復(fù)制3.2環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制整理課件3.1線性DNA雙鏈的復(fù)制3.1.1線性DNA復(fù)制的具體表現(xiàn)3.1.2線性DNA復(fù)制時(shí)末端問題的提出3.1.3線性DNA復(fù)制時(shí)末端問題的解決方案整理課件3.1.1線性DNA復(fù)制的具體表現(xiàn)整理課件

3.1.2線性DNA復(fù)制時(shí)末端問題的提出所有的核酸聚合酶，無論是DNA聚合酶還是RNA聚合聚合酶都只從5`端向3`端移動(dòng)，新鏈的合成方向與聚合酶移動(dòng)方向一致，即只能是5`→3`；而對于DNA的合成必需一段引物的存在，體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后它必須切除，切除后，5`端如何起始呢？這就提出了線性DNA末端復(fù)制的問題。整理課件整理課件復(fù)制能在新合成鏈的3`端結(jié)束，它如何在5`端啟動(dòng)呢？整理課件

3.1.3線性DNA復(fù)制時(shí)末端問題的解決方案(1〕通過將線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子。如λ噬菌體：滾環(huán)產(chǎn)生多聚復(fù)制子〕；(2〕某種蛋白質(zhì)可能會(huì)介入，在真正的末端上啟動(dòng)。幾種線性病毒核酸具有與5`端堿基共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中了解最清楚的例子是腺病毒DNA)。(3〕DNA可形成特殊的結(jié)構(gòu)，如在末端形成發(fā)夾。使分子沒有游離末端。草履蟲〔Paramecium〕的線性線粒體DNA的復(fù)制中就形成了一種交聯(lián)；(4〕末端是可變的，而不是精確確定的。真核生物染色體可能采用這種方式，在這種情況下，DNA末端的短重復(fù)序列的拷貝數(shù)改變〔如端粒的復(fù)制〕；整理課件〔1〕通過將線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子整理課件TherollingcirclereplicatesDNAPhageλ整理課件Arollingcircleappearsasacircularmoleculewithalineartailbyelectronmicroscopy.整理課件整理課件Adenovirusterminalproteinbindstothe5`endofDNAandprovidesaC-OHendtoprimesynthesisofanewDNAstrand.〔2〕某種蛋白質(zhì)介入而在真正的末端啟動(dòng)復(fù)制整理課件AdenovirusDNAreplicationisinitiatedseparatelyatthetwoendsofthemoleculeandproceedsbystranddisplacement.〔3〕DNA末端形成特殊結(jié)構(gòu)整理課件AtypicaltelomerehasasimplerepeatingstructurewithaG-T-richstrandthatextendsbeyondtheC-A-richstrand.TheG-tailisgeneratedbyalimiteddegradationoftheC-A-richstrand.〔4〕末端長度可變整理課件AloopformsattheendofchromosomalDNA.整理課件The3single-strandedendofthetelomere(TTAGGG)ndisplacesthehomologousrepeatsfromduplexDNAtoformat-loop.整理課件Watchingflash整理課件3.2環(huán)狀DNA的復(fù)制3.2.1θ-復(fù)制3.2.2滾環(huán)復(fù)制3.2.3D-環(huán)復(fù)制整理課件3.2.1θ-復(fù)制

replicationbyθ-structure整理課件3.2.2滾環(huán)復(fù)制replicationbyrollingcyclesstructureφX174噬菌體由一個(gè)單鏈環(huán)狀DNA組成，這條鏈稱為正〔+〕鏈；合成的互補(bǔ)鏈稱為負(fù)〔一〕鏈。雙鏈體的復(fù)制以滾環(huán)復(fù)制方式進(jìn)行。整理課件TheAproteiniscis-actingPhageφX174Thereplicationbyrollingcyclestructure整理課件3.2.3D-環(huán)復(fù)制Replicationbydisplacementloopstructure整理課件D-環(huán)復(fù)制〔Replicationbydisplacementloopstructure)整理課件4DNA聚合酶4.1大腸桿菌DNA聚合酶的種類及其功能4.2真核生物DNA聚合酶的種類及其功能4.3DNA聚合酶所具有的共同結(jié)構(gòu)整理課件4.1大腸桿菌DNA聚合酶的種類及其功能SOS修復(fù)整理課件性質(zhì)聚合酶I聚合酶II聚合酶III3`→5`外切+++5`→3`外切+--新生鏈的合成--+生物學(xué)活性10.0515生物學(xué)功能切除引物修復(fù)DNA修復(fù)DNA復(fù)制4.1.1大腸桿菌DNA聚合酶I、II、III的性質(zhì)比較整理課件〔1〕DNA聚合酶I103kDa的單鏈多肽，可以被蛋白酶切成兩段，C端的2/3包括聚合酶活性位點(diǎn)；N端的1/3包含核酸外切酶校正活性〔一次可切除1-10個(gè)堿基〕?！?〕利用DNA聚合酶I進(jìn)行缺口平移法制備探針的根本原理4.1.2DNA聚合酶I與缺口平移法制備探針整理課件Nicktranslationreplacespartofapre-existingstrandofduplexDNAwithnewlysynthesizedmaterial.DNaseⅠ整理課件4.2真核生物DNA聚合酶的種類及其功能整理課件整理課件真核生物由不同DNA聚合酶

分別負(fù)責(zé)起始和延伸三種細(xì)胞核DNA復(fù)制酶具有不同的功能:DNApolymeraseα起始新鏈合成DNApolymeraseδ延伸先導(dǎo)鏈DNApolymeraseε可能與后隨鏈合成有關(guān)，也可能具有其他功能整理課件4.3DNA聚合酶所具有的共同結(jié)構(gòu)許多DNA聚合酶有一個(gè)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的大裂隙，類似于手形。整理課件ThecommonorganizationofDNApolymeraseshasapalmthatcontainsthecatalyticsite,fingersthatpositionthetemplate,athumbthatbindsDNAandisimportantinprocessivity,anexonucleasedomainwithitsownactivesite,andanN-terminaldomain.整理課件5原核生物DNA復(fù)制的根本過程5.1DNA復(fù)制的起始5.2DNA合成鏈的延伸5.3DNA復(fù)制的終止整理課件5.1.1單鏈DNA的產(chǎn)生5.1.23`-OH引發(fā)末端的產(chǎn)生5.1.3復(fù)制復(fù)合體的形成

5.1DNA復(fù)制的起始整理課件5.1.1單鏈DNA的產(chǎn)生解旋酶(helicase):使DNA的兩條鏈分開，它通常利用ATP水解來提供必需的能量；整理課件拓?fù)洚悩?gòu)酶〔DNATopisomerase〕拓?fù)洚悩?gòu)酶的種類分為Ⅰ型和Ⅱ型。原核拓?fù)錁?gòu)酶Ⅰ：MW=100kD，單肽鏈，含3~4個(gè)Zn。作用是暫時(shí)切斷一條DNA鏈，形成酶-DNA共價(jià)中間物而使超螺旋DNA松弛，然后再將切斷的單鏈DNA連接起來。每次改變一個(gè)連環(huán)數(shù)。整理課件原核拓?fù)錁?gòu)酶Ⅰ作用機(jī)制：①酶與DNA結(jié)合使雙鏈解旋；②使一條鏈切開，但酶與切口的兩端結(jié)合阻止了螺旋的旋轉(zhuǎn)；③酶使另一條鏈經(jīng)過缺口，然后再將兩斷端連接起來；④酶從DNA上脫落，兩條鏈復(fù)原，得到的DNA比原來少一個(gè)負(fù)超螺旋。整理課件拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ也稱旋轉(zhuǎn)酶。廣泛存在于各種生物中。使正超螺旋轉(zhuǎn)化為負(fù)超螺旋，每次改變兩個(gè)連接數(shù)。整理課件ReplicationmachineryreplicationPositivesupercoilBreakDNATopoisomeraseIIpassDNAthroughthebreaknegativesupercoil整理課件單鏈結(jié)合蛋白〔single-strandbindingprotein):單鏈DNA結(jié)合，阻止其再形成雙鏈體狀態(tài)φX174噬菌體的DNA在三種功能蛋白先后作用下分開成為單鏈：在復(fù)制起始點(diǎn)，噬菌體A蛋白使病毒〔+〕鏈產(chǎn)生缺口。Rep蛋白提供解旋酶活性，它使兩鏈別離。SSB包繞單鏈形成穩(wěn)定的單鏈形式。ThreeproteinsunwindφX174DNA整理課件5.1.23`-OH引發(fā)末端的產(chǎn)生整理課件多種方法可以產(chǎn)生3`-OH末端1)3)2)整理課件起始需要解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白和引發(fā)酶5.1.3復(fù)制復(fù)合體的形成整理課件5.2DNA合成鏈的延伸5.2.1半保存復(fù)制合成兩條新的DNA鏈5.2.2DNA的合成是半不連續(xù)的5.2.3連接酶將岡崎片段連接在一起5.2.4前導(dǎo)鏈和后隨鏈的協(xié)調(diào)合成5.2.5DNA復(fù)制忠實(shí)性的控制整理課件(1)半保存復(fù)制的概念DNA在復(fù)制時(shí)，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補(bǔ)的原那么合成兩條與模板鏈互補(bǔ)的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個(gè)DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模@種復(fù)制方式稱為半保存復(fù)制(semiconsertivereplication)。5.2.1半保存復(fù)制合成兩條新的DNA鏈整理課件(2)半保存復(fù)制實(shí)驗(yàn)證據(jù)〔Meselson-Stahl)1958年Meselson&stahl用同位素〔15N〕示蹤標(biāo)記加密度梯度離心技術(shù)實(shí)驗(yàn),該實(shí)驗(yàn)跟蹤了生長了三代的大腸桿菌，證明了DNA是采取半保存的方式進(jìn)行復(fù)制。[15N][15N-14N][14N][15N-14N][15N-14N]整理課件5.2.2DNA的合成是半不連續(xù)的

〔semidiscontinuousreplication)DNA復(fù)制在合成先導(dǎo)鏈〔leadingstrand)時(shí)是連續(xù)的；而在合成后隨鏈(laggingstrand)時(shí)是先形成小片段〔Okazakifragment〕，隨后再將它們連接而成大片段。因后隨鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)合成的而先導(dǎo)鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，所以我們稱之為半不連續(xù)復(fù)制〔semidiscontinuousreplication)。整理課件兩條新鏈具有不同的特征ThetwonewDNAstrandshavedifferentfeaturesOkazakifragment整理課件5.2.3連接酶〔Ligase)將Okazakifragment連接在一起整理課件5.2.4前導(dǎo)鏈(Leadingstrand))和后隨鏈(laggingstrand)的協(xié)調(diào)合成整理課件5.2.5DNA聚合酶控制復(fù)制的忠實(shí)性整理課件DNA聚合酶造成的復(fù)制錯(cuò)誤可分為兩類：移碼〔frameshift):指一個(gè)核苷酸的插入或缺失。替換〔