第十四章

基因重組與基因工程1/7/2024分子生物學原理基因重組：genomicrecombination重組DNA：recombinantDNA1/7/2024分子生物學原理第一節(jié)、自然界的基因重組轉(zhuǎn)化：transformation整合：integration轉(zhuǎn)導：transduction轉(zhuǎn)位：transposition1/7/2024分子生物學原理轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：由外來DNA引起生物類型改變的過程稱為轉(zhuǎn)化。細菌的轉(zhuǎn)化1/7/2024分子生物學原理轉(zhuǎn)化病毒癌基因感染宿主細胞后，可整合到宿主染色體上，從而使宿主細胞癌變。轉(zhuǎn)染：噬菌體感染宿主菌后，核酸進入菌體內(nèi)的過程。細胞的轉(zhuǎn)化1/7/2024分子生物學原理整合整合：

噬菌體感染大腸桿菌的第一步噬菌體粘附于細胞壁上，將自身的DNA注入菌體中。此DNA可與細菌染色體重組，成為細菌染色體的一部分。溶原菌：整合了噬菌體基因組的細菌。裂解：噬菌體感染大腸桿菌的第二步DNA利用菌體的酶系統(tǒng)，復制自身及外殼蛋白，組裝成大量新噬菌體，并將細菌漲破。1/7/2024分子生物學原理轉(zhuǎn)位轉(zhuǎn)位：一個或一組基因從一處轉(zhuǎn)到基因組的另一個位置。這些游動的基因稱為轉(zhuǎn)位子(transposon)。1/7/2024分子生物學原理轉(zhuǎn)位1/7/2024分子生物學原理第二節(jié)、基因工程基因工程：是用分離純化或人工合成的DNA在體外與載體DNA結(jié)合，成為重組DNA，用以轉(zhuǎn)化宿主，篩選出能表達重組DNA的活細胞，加以純化、傳代、擴增，成為克隆。也叫基因克隆或重組DNA技術(shù)。分子水平上操作，細胞水平上表達。賦予重組DNA以新的生命力。1/7/2024分子生物學原理基因工程腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移與細胞表面的糖鏈類型有關(guān)，而后者又與糖基轉(zhuǎn)移酶的表達相關(guān)。已經(jīng)證實GnT-Ⅴ與轉(zhuǎn)移有關(guān)。轉(zhuǎn)入GnT-Ⅴ基因肝癌細胞株SMMC7721觀察其遷移、侵襲、粘附等生物學行為轉(zhuǎn)入反義GnT-Ⅴ基因轉(zhuǎn)移

轉(zhuǎn)移

1/7/2024分子生物學原理基因克隆分切接轉(zhuǎn)篩1/7/2024分子生物學原理載體和目的基因載體：vector在宿主細胞內(nèi)可獨立復制的完整DNA分子。但必須利用宿主的酶系統(tǒng)，才能有進一步的基因表達能力。常用的載體有：質(zhì)粒、噬菌體、M13噬菌體逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA、昆蟲病毒DNA載體與宿主共培育可大量生成，經(jīng)純化后可用于基因工程。1/7/2024分子生物學原理質(zhì)粒質(zhì)粒：plasmid環(huán)形雙鏈DNA，大小約為數(shù)千堿基對，存在于大多數(shù)細菌的胞質(zhì)中。拷貝數(shù)：每個細菌能容納的質(zhì)粒數(shù)目。質(zhì)粒的性質(zhì)：易于從一個細菌轉(zhuǎn)移入另一個細菌。有兩三個抗藥性基因。有一個限制性內(nèi)切酶切口。1/7/2024分子生物學原理質(zhì)粒pBR322：常用的質(zhì)粒1/7/2024分子生物學原理噬菌體載體噬菌體、M13噬菌體易于感染大腸桿菌噬菌體DNA比質(zhì)粒大，對限制性內(nèi)切酶有不止一個切口，需經(jīng)過改造。一個切口：插入型載體。二個切口：置換型載體。1/7/2024分子生物學原理噬菌體載體1/7/2024分子生物學原理目的基因的來源直接從染色體DNA中分離：原核生物人工合成：簡單的多肽從mRNA合成cDNA：真核生物基因文庫：(genelibrary）G文庫：用基因組的全部DNA制備。c文庫：用細胞的全部mRNA制備出全套cDNA后建庫。1/7/2024分子生物學原理從mRNA合成cDNA1/7/2024分子生物學原理限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用限制性內(nèi)切酶可辨認4~6個核苷酸：回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)：palindromeDNA雙鏈具有方向相反順序一致的結(jié)構(gòu)。平端：bluntend在同一水平上切斷兩條鏈。(鈍型末端)粘性末端：stickyend堿基序列被酶以錯開幾個核苷酸的形式切開。1/7/2024分子生物學原理限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用AluI….AGCT…..….AGCT...

平端

…..TCGA…..….TCGA...

BamHI…GGATCC…...GGATTC…

粘性...CCTAGG…

…CCTAAG

G…

末端

1/7/2024分子生物學原理限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用切載體切目的基因限制性內(nèi)切酶相同粘性末端兩者相連要點：避免切斷目的基因1/7/2024分子生物學原理載體和目的基因的連接人工連接器：linker人工合成的寡核苷酸，安置有限制性內(nèi)切酶的識別序列。DNA連接酶：可用于連接堿基互補的二段核酸鏈。連接方式：粘端連接方式

尾接法1/7/2024分子生物學原理粘端連接1/7/2024分子生物學原理尾接法1/7/2024分子生物學原理重組體的轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)移：重組體進入宿主細胞的過程，已開發(fā)了很多方法。化學法：CaCl2轉(zhuǎn)移法、堿金屬離子轉(zhuǎn)移法物理法：顯微注射法、基因槍法、電穿孔法生物學法：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體1/7/2024分子生物學原理重組體的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：重組載體導入宿主后，利用宿主的酶系統(tǒng)表達的過程。即改變宿主性狀的過程。1/7/2024分子生物學原理基因工程的表達體系的發(fā)展1/7/2024分子生物學原理DNA重組體的篩選與鑒定根據(jù)重組載體的表型進行篩選：如質(zhì)粒的抗藥性、營養(yǎng)素的依賴型DNA限制酶切圖譜分析：提取經(jīng)粗選后的宿主DNA，用限制性內(nèi)切酶切割后與原來載體比較。利用核酸雜交和放射自顯影進行鑒定：用目的基因作探針監(jiān)測宿主DNA是否重組體。1/7/2024分子生物學原理DNA重組體的篩選與鑒定滅活法篩選重組體。1/7/2024分子生物學原理提取轉(zhuǎn)化細胞DNA限制性內(nèi)切酶瓊脂糖凝膠電泳與原來載體及重組體比較DNA重組體的篩選與鑒定1/7/2024分子生物學原理DNA重組體的篩選與鑒定菌落硝酸纖維素濾膜探針X線底片顯影平板1/7/2024分子生物學原理基因工程策略1/7/2024分子生物學原理第三節(jié)、基因工程的應(yīng)用生命科學研究趨勢基因診斷和基因治療基因工程產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用1/7/2024分子生物學原理生命科學研究趨勢基因的結(jié)構(gòu)與功能研究基因表達的調(diào)控各種生物大分子之間的識別及結(jié)合了解生命的奧秘1/7/2024分子生物學原理基因診斷和基因治療1/7/2024分子生物學原理基因工程產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用基因工程疫苗：安全廉價乙肝疫苗、甲肝疫苗巨細胞病毒、流行性出血熱、輪狀病毒、基因工程生產(chǎn)激素類：胰島素、生長激素細胞因子：生長因子、腫瘤壞死因子、造血因子、干擾素1/7/2024分子生物學原理第五節(jié)、聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)：PCR