腫瘤中可變剪切的調(diào)控機(jī)制及作為治療靶點(diǎn)

的意義【摘要】mRNA可變剪切是一種常見(jiàn)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，其異常調(diào)控與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。多種機(jī)制可以導(dǎo)致可變剪切變化，包括基因在發(fā)生剪切位置發(fā)生突變、剪切因子本身突變或表達(dá)異常以及腫瘤細(xì)胞中系統(tǒng)性的剪切異常?？勺兗羟械淖儺惪梢栽斐梢职┗虿槐磉_(dá)或誘導(dǎo)特定的促癌蛋白形成。同時(shí)，這類剪切也可以成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。目前已經(jīng)有多種小分子化合物可以靶向抑制可變剪切，在臨床前研究中證實(shí)具有有效的抗癌作用。進(jìn)一步的研究需要對(duì)可變剪切異常所造成的腫瘤生物學(xué)功能影響做進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，以及靶向可變剪切針對(duì)特定腫瘤患者，特別是存在剪切因子突變患者中的治療效果?！娟P(guān)鍵詞】可變剪切；剪切因子；突變；腫瘤在基因表達(dá)的過(guò)程中，信使RNA(messengerRNA,mRNA)前體剪切成為成熟的mRNA至關(guān)重要。剪切的主要目的是去除非編碼內(nèi)含子區(qū)域，通過(guò)由多種蛋白和RNA組成的剪切體完成。由于多數(shù)基因都具有多個(gè)交叉的外顯子和內(nèi)含子，同一基因不同的內(nèi)含子剪切方式可以導(dǎo)致最終翻譯產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。這種mRNA前體剪切的極大靈活性也被稱為可變剪切(alternativesplicing,AS)，它能夠極大地?cái)U(kuò)展細(xì)胞的蛋白組表達(dá)種類。盡管大多數(shù)由于AS所產(chǎn)生的蛋白亞型功能尚不明確，但有研究指出特定的蛋白質(zhì)亞型可能參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展［1］。腫瘤細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)有多種機(jī)制可以導(dǎo)致異常的可變剪切。首先，mRNA剪切位置附近對(duì)應(yīng)的基因位點(diǎn)上發(fā)生變異，從而誘導(dǎo)剪切錯(cuò)位［2］。其次，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)腫瘤中廣泛存在整體性的剪切異常，例如無(wú)法有效移除內(nèi)含子［3］。最后，編碼剪切體相關(guān)蛋白的基因發(fā)生突變，這類突變?cè)谀承┠[瘤中發(fā)生的頻率較高，直接導(dǎo)致剪切過(guò)程錯(cuò)亂或無(wú)效［4］。本文將討論各種可變剪切異常的調(diào)控以及對(duì)腫瘤的生物學(xué)影響，以及剪切作為潛在腫瘤治療靶點(diǎn)的可能性和研究現(xiàn)狀。RNA可變剪切的調(diào)控RNA剪切是通過(guò)剪切體這一大分子復(fù)合物實(shí)現(xiàn)的，剪切體中包含多種小核糖核蛋白(smallnuclearribonucleoprotein,snRNP)，每種snRNP都擁有一個(gè)對(duì)應(yīng)的非編碼RNA和一個(gè)Sm或類Sm蛋白復(fù)合體［5］。內(nèi)含子的剪切是通過(guò)識(shí)別mRNA前體上的短序列模體，特別是在上游外顯子和內(nèi)含子交界處(5'剪切部位)以及內(nèi)含子和下游外顯子交界處(3'剪切部位)。不同的snRNP在剪切過(guò)程中發(fā)揮各自的功能，U1snRNP負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合至5'剪切部位，而U2snRNP在U2輔助因子(U2auxiliaryfactors,U2AFs)的參與下可以與3'剪切部位附近的分支點(diǎn)區(qū)域相互作用。隨著U4/U6/U5snRNP被募集，組裝成的剪切體變?yōu)榛罨臉?gòu)象，并通過(guò)兩次連續(xù)的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)完成剪切［6］。事實(shí)上，可變剪切處于一種動(dòng)態(tài)變化的狀態(tài)。不同細(xì)胞中相同基因的剪切方式可能不同，同一個(gè)細(xì)胞在受到不同的刺激下剪切類型也會(huì)發(fā)生改變。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)于RNA剪切的定量檢測(cè)可以做到更為快速和準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。同時(shí)，可變剪切也受到反式作用剪切因子的調(diào)控，這些反式作用因子能夠結(jié)合到相應(yīng)的模式序列上來(lái)增強(qiáng)或減弱剪切，其中最主要的包括富絲氨酸/精氨酸蛋白(serine/arginine-richproteins,SR蛋白)和核不均一核糖核蛋白(heterogeneousnuclearribonucleoproteins,hnRNPs)。它們都具有在氨基端的RNA識(shí)別模式區(qū)域和碳端負(fù)責(zé)蛋白之間結(jié)合的區(qū)域。傳統(tǒng)認(rèn)為SR蛋白和hnRNPs分別促進(jìn)和抑制剪切，但最新的研究顯示它們與mRNA前體之間的結(jié)合取決于環(huán)境因素，具有復(fù)雜的相互調(diào)控關(guān)系，在不同的刺激條件下對(duì)剪切的作用會(huì)完全相反。此外，質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果顯示剪切體與超過(guò)170種蛋白質(zhì)相結(jié)合，而生物信息學(xué)分析證實(shí)外顯子中至少有上百個(gè)模式序列負(fù)責(zé)調(diào)控剪切。因此，mRNA的剪切是一個(gè)涉及多種蛋白質(zhì)、RNA相互調(diào)控的負(fù)責(zé)生物學(xué)過(guò)程。腫瘤相關(guān)可變剪切的異常調(diào)控機(jī)制剪切位置序列對(duì)應(yīng)基因位點(diǎn)的變異大規(guī)模的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)顯示腫瘤與對(duì)應(yīng)的正常對(duì)照組織之間在RNA加工過(guò)程存在巨大差異。其中，幾乎所有的腫瘤都具有內(nèi)含子保留異常，頻率遠(yuǎn)高于其它類型的剪切改變，包括盒式外顯子剪切、5'或3'剪切部位識(shí)別。兩項(xiàng)較新的研究在整合了同一腫瘤患者的全外顯子、全基因組和RNA測(cè)序的數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)大量體細(xì)胞突變可以直接影響RNA剪切，而這些單核苷酸變異更傾向于誘導(dǎo)內(nèi)含子保留。同時(shí)這種內(nèi)含子保留更多發(fā)生在抑癌基因中，因?yàn)閹缀跛羞@種內(nèi)含子保留都導(dǎo)致終止密碼子形成。受到影響的常見(jiàn)抑癌基因包括TP53、ARID1A和PTEN等。相反，在癌基因中由于堿基變異導(dǎo)致的剪切異常則經(jīng)常誘導(dǎo)該基因活化。例如，肺癌中特定突變誘導(dǎo)MET基因14號(hào)外顯子被異常剪切所去除，所形成的MET蛋白在靠近細(xì)胞膜的區(qū)域缺失，增強(qiáng)MET受體信號(hào)通路激活。而NOTCH1基因突變所導(dǎo)致的隱蔽剪接位點(diǎn)活化，在慢性淋巴細(xì)胞白血病中可以誘導(dǎo)異常激活的NOTCH1蛋白［7］。剪切體相關(guān)基因突變除了基因突變直接導(dǎo)致基因相關(guān)剪切位點(diǎn)異常之外，剪切體中相關(guān)因子的突變則可以在更大程度上影響mRNA剪切。目前研究報(bào)道較多發(fā)生突變的剪切因子包括SF3B1、U2AF1、SRSF2以及ZRSR2⑷起初，這些突變是在血液系統(tǒng)腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，如骨髓增生異常綜合征、慢性淋巴細(xì)胞白血病，隨后在實(shí)體瘤中也發(fā)現(xiàn)了相關(guān)基因的突變。在不同腫瘤類型中，相關(guān)基因的突變頻率和變異位點(diǎn)存在較大差異，提示其所導(dǎo)致的功能改變并不相同。但是，該類基因突變的特征提示它們很可能是參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵因素。首先，除ZRSR2外,SF3B1、U2AF1和SRSF2基因突變均以雜合子的形式導(dǎo)致高度集中的個(gè)別氨基酸位點(diǎn)發(fā)生改變，提示它們很可能會(huì)引起功能獲得或改變。其次，不同剪切因子突變并不同時(shí)存在，可能是由于功能冗余或協(xié)同致死。剪切相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)異常在不存在特定基因突變的情況下，剪切相關(guān)基因表達(dá)水平的變化也可以改變正常剪切過(guò)程，從而影響腫瘤的生長(zhǎng)。某些SR蛋白過(guò)表達(dá)后發(fā)揮促癌作用。例如剪切因子SRSF1在肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)上調(diào)。在小鼠正常乳腺上皮細(xì)胞中輕度過(guò)表達(dá)SRSF1就可以誘導(dǎo)細(xì)胞永生化，研究發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化是通過(guò)誘導(dǎo)MNK2和S6K1基因的剪切異常，激活mTOR通路。hnRNPs表達(dá)異常也與腫瘤密切相關(guān)。有兩項(xiàng)研究報(bào)道在膠質(zhì)瘤中MYC介導(dǎo)的特定hnRNPs上調(diào)可以導(dǎo)致PKM基因的9號(hào)外顯子被排除，促進(jìn)了腫瘤相關(guān)PKM胚胎亞型的表達(dá)和有氧糖酵解。而EGFR的持續(xù)活化亞型EGFRvIII能夠上調(diào)hnRNPA1的表達(dá)，導(dǎo)致MAX可變剪切形成DeltaMAX,促進(jìn)糖酵解相關(guān)基因表達(dá)和膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。最新的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病中SRSF3表達(dá)異?？梢砸餋D19剪切狀態(tài)改變，導(dǎo)致靶向CD19的CAR-T治療失效。靶向RNA剪切的腫瘤治療策略考慮到可變剪切在腫瘤中的重要作用以及剪切因子在某些腫瘤中存在突變，因此研究人員猜測(cè)干預(yù)剪切調(diào)控可能具有抗腫瘤效果。目前，有多種化合物抑制劑可以靶向RNA剪切，其中作用于核心剪切體形成的藥物研究最多，它們均通過(guò)結(jié)合到U2snRNP上的SF3B來(lái)干擾早期剪切體的組裝，包括pladienolide、spliceostatinA和sudemycin以及其類似物，優(yōu)化合成技術(shù)后還產(chǎn)生了E7107等在化學(xué)穩(wěn)定性方面更好的藥物類型。這類藥物作用于細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致大量非剪切的mRNA前體在核內(nèi)聚集，只有少部分未剪切的mRNA前體進(jìn)入胞漿翻譯為異常的蛋白產(chǎn)物，從而影響腫瘤細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。目前腫瘤中所發(fā)現(xiàn)的剪切因子突變均表現(xiàn)為雜合子，而研究證實(shí)其中野生型的等位基因?qū)S持細(xì)胞存活至關(guān)重要。因此，靶向剪切的藥物在剪切因子突變的腫瘤中會(huì)具有更好的治療效果。例如，在小鼠白血病模型中，E7107對(duì)SRSF2突變小鼠的腫瘤細(xì)胞殺傷作用更強(qiáng)⑻。同樣，SF3B1和U2AF1突變的腫瘤細(xì)胞對(duì)這類抑制劑更敏感。由于在臨床前研究中具有良好的效果，E1707已經(jīng)開(kāi)展針對(duì)局部進(jìn)展和轉(zhuǎn)移實(shí)體瘤的I期臨床試驗(yàn)。除了針對(duì)剪切因子突變的腫瘤具有潛在的治療效果外，研究發(fā)現(xiàn)這類藥物可能對(duì)依賴MYC基因的腫瘤亞型具有更好的療效。MYC被認(rèn)為是影響腫瘤的一個(gè)關(guān)鍵癌基因，部分腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展依賴MYC。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在MYC過(guò)表達(dá)的乳腺上皮細(xì)胞中，增強(qiáng)的可變剪切活動(dòng)對(duì)于維持細(xì)胞存活必不可少，可能是由于MYC激活導(dǎo)致大量mRNA前體合成，需要相應(yīng)增強(qiáng)的剪切來(lái)產(chǎn)生足夠的蛋白產(chǎn)物。抑制剪切調(diào)控蛋白BUD31的表達(dá)對(duì)這類細(xì)胞存在協(xié)同致死效應(yīng)。同時(shí)，對(duì)MYC活化的乳腺癌荷瘤模型給予sudemycinD治療可以顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)[9]。此外，MYC還可以直接上調(diào)snRNP組裝調(diào)控基因Prmt5的表達(dá)促進(jìn)可變剪切輕，MYC依賴的腫瘤細(xì)胞通過(guò)調(diào)控可變剪切來(lái)誘導(dǎo)特殊PKM蛋白亞型產(chǎn)生，這些現(xiàn)象都提示靶向RNA剪切是治療依賴MYC的腫瘤的一種潛在策略。此外，正如增加的體細(xì)胞突變負(fù)荷可以產(chǎn)生新抗原表位并使得腫瘤對(duì)免疫治療敏感一樣，可變剪切的異常調(diào)控也能夠?qū)е庐惓RNA和新抗原表位的產(chǎn)生。因此，存在剪切因子突變的腫瘤是否是判斷免疫治療敏感性的一個(gè)指標(biāo)值得進(jìn)一步的研究?？偨Y(jié)腫瘤中存在顯著的可變剪切異常調(diào)控，包括剪切因子的突變、相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)異常等，這些生物學(xué)過(guò)程都可能參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。但是目前對(duì)變異所導(dǎo)致的具體剪切位置和外顯子識(shí)別的改變尚缺乏足夠的認(rèn)識(shí)，而且對(duì)特定因子變異所造成的腫瘤生物學(xué)功能變化沒(méi)有深入的研究。相同的變異在不同腫瘤中可能具有差別的作用，而不同的因子或突變位點(diǎn)很可能對(duì)功能學(xué)的影響存在差異。另一方面，可變剪切可能成為腫瘤治療中的一個(gè)有效靶點(diǎn)，臨床前研究已經(jīng)提示靶向剪切的藥物具有抗腫瘤作用。特別是隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，對(duì)特定剪切因子變異的鑒定能夠篩選出對(duì)該類藥物敏感的腫瘤亞組患者?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】DvingeH,KimE,Abdel-WahabO,etal.RNAsplicingfactorsasoncoproteinsandtumoursuppressors[J].NatRevCancer,2016,16(7):413-430.JungH,LeeD,etal.Intronretentionisawidespreadmechanismoftumorsuppressorinactivation[J].NatGenet,2015,47(11):1242-1248.DvingeH,BradleyRK.Widespreadintronretentionpersifiesmostcancertranscriptomes[J].GenomeMed,2015,7(1):45.YoshidaK,SanadaM,ShiraishiY,etal.Frequentpathwaymutationsofsplicingmachineryinmyelodysplasia[J].Nature,2011,478(7367):64-69.WahlMC,WillCL,LuhrmannR.Thespliceosome:designprinciplesofadynamicRNPmachine[J].Cell,2009,136(4):701-718.MateraAG,WangZ.Adayinthelifeofthespliceosome[J].NatRevMolCellBiol,2014,15(2):108-121.PuenteXS,BeaS,Valdes-MasR,etal.Non-codingrecurrentmutationsinchroniclymphocyticleukaemia[J].Nature,2015,526(7574):519-524.FeiDL,MotowskiH,ChatrikhiR,etal.Wild-typeU2AF1antagonizesthesplicingprogramcharacteristicofU2AF1-mutanttumorsandisrequiredforcellsurvival[J].PLoSGenet,2016,12(10):e1006384.HsuTY,SimonLM,NeillNJ,e