天然藥物化學(xué)成分的

提取方法天然藥物化學(xué)成分的主要類型

1生物堿：為一類存在于生物體內(nèi)分子中含有氮原子的有機化合物的總稱；一般具有堿性，可與酸成鹽。游離生物堿具親脂性；生物堿鹽具親水性。2苷類（甙類）：為一類經(jīng)水解后可產(chǎn)生糖和非糖兩部分的化合物。非糖部分叫苷元。苷具親水性，苷元具親脂性。3揮發(fā)油：為一類可隨水蒸氣蒸餾出來的與水不相混溶的油狀液體的總稱。具有香味或特殊氣味的中藥往往都含有揮發(fā)油。揮發(fā)油具親脂性。以上三類為主要的有效成分類型。

4糖類：為中藥中普遍存在的成分類型，包括單糖、低聚糖、多糖。單糖是糖的基本單位；低聚糖是由2~9個單糖脫水縮合而成的化合物。多糖是由10個以上至上千個單糖脫水縮合而成的高聚物。

5有機酸：廣義的有機酸泛指分子中有羧基的化合物。在植物中多以金屬離子或生物堿鹽的形式存在。按分子大小又分為小分子有機酸和大分子有機酸。前者極性大，具親水性；后者極性小，具親脂性。

6樹脂：為植物組織中樹脂道的分泌物。性脆，受熱時先軟化而后變?yōu)橐后w，燃燒時發(fā)生濃煙并有明火。樹脂具親脂性。按結(jié)構(gòu)又分為樹脂酸（主要為二萜酸、三萜酸及其衍生物）、樹脂醇（分子中具羥基）、樹脂烴（為一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含氧中性化合物）類。

7氨基酸、蛋白質(zhì)和酶：（1）氨基酸：分子中含有氨基的羧酸。構(gòu)成蛋白質(zhì)的多為α-氨基酸。為親水性。在等電點時，溶解度最小。（2）蛋白質(zhì)、多肽：蛋白質(zhì)為二十多種α-氨基酸通過肽鍵首尾相連而成的高分子化合物，多肽亦為。但二者分子量不同，一般將分子量在5×103以下稱為多肽，而介于5×103~1×107之間稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在冷水中溶解且成膠體，在熱水、60%以上乙醇及其它有機溶劑中變性沉淀。（3）酶：是有機體內(nèi)具有催化作用的蛋白質(zhì)，其催化作用具有專屬性，如特定的酶可催化水解特定的苷。酶的性質(zhì)和蛋白質(zhì)相同。

8鞣質(zhì)：又稱單寧或鞣酸，為一類分子較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多元酚類化合物的總稱?？膳c蛋白質(zhì)結(jié)合成難溶于水的鞣酸蛋白。為親水性物質(zhì)。

9植物色素：為植物中具有顏色的成分的總稱。依溶解性又分為水溶性和脂溶性色素；前者主要指一些有顏色的苷、花青素，后者主要包括葉綠素、胡羅卜素等

10油脂和蠟：油脂為一分子甘油和三分子脂肪酸脫水結(jié)合形成的酯。主要在種子中。常溫下為液體。蠟為高級不飽和脂肪酸和一元醇生成的酯。主要在植物莖、葉的表面。常溫下為固體。均為親脂性成分天然藥物化學(xué)成分提取分離方法的基本原理及應(yīng)用

1、提?。豪眠m當(dāng)?shù)娜軇┗蚍椒?，將所要成分盡可能從原料中完全提出的過程。2、分離：將提取物中所含的各種成分一一分開，并將得到的單體加以精制的過程。第一節(jié)

提取方法一、溶劑提取法二、水蒸氣蒸餾提取法三、超臨界流體萃取法

四、升華法（一）溶劑提取法

原理：

根據(jù)中藥化學(xué)成分與溶劑間“極性相似相溶”的原理，依據(jù)各類成分溶解度的差異，選擇對所提成分溶解度大、對雜質(zhì)溶解度小的溶劑，依據(jù)“濃度差”原理，將所提成分從藥材中溶解出來的方法。相似相溶選擇溶劑的原則

1、溶劑對有效成分溶解度大，對雜質(zhì)溶解度小2、沸點適中容易回收3、溶劑不能與中藥的成分起化學(xué)變化4、溶劑要經(jīng)濟(jì)、易得、使用安全等溶劑的分類

*強極性溶劑：水*親水性有機溶劑：

能與水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮）*親脂性有機溶劑：

不與水任意混溶，可分層（正丁醇及其以后的試劑）常用溶劑的極性大小順序：石油醚<四氯化碳<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇（甲醇）<水提取溶劑的選擇被提取成分的極性是選擇提取溶劑最重要的依據(jù)。（1）分子結(jié)構(gòu)中親水性基團(tuán)（羧基、羥基、氨基）越多，極性越大，親水性越強，反之則親脂性越強。（2）分子中非極性部分越大，碳鏈越長或結(jié)構(gòu)越大，則親脂性越強。（3）結(jié)構(gòu)母核相同的成分，分子中功能基的極性越大，或極性功能基數(shù)量越多，則整個分子的極性越大，親水性越強，親脂性越弱。常見基團(tuán)極性大小順序如下：

酸＞酚＞醇＞胺＞醛＞酮＞酯＞醚＞烯＞烷-COOH>Ar-OH>R-OH>

>

>-NH2>-SH>

>

>HN(CH3)2>-NO2>

>

>R-中藥化學(xué)成分不但數(shù)量繁多，而且結(jié)構(gòu)千差萬別。所以極性問題很復(fù)雜。但依據(jù)以上三點，一般可以判定。需要大家判斷的大多數(shù)是母核相同或相近的化合物，此時主要依據(jù)取代基極性大小。中藥化學(xué)成分不但數(shù)量繁多，而且結(jié)構(gòu)千差萬別。所以極性問題很復(fù)雜。但依據(jù)以上三點，一般可以判定。需要大家判斷的大多數(shù)是母核相同或相近的化合物，此時主要依據(jù)取代基極性大小。舉例：判斷下列各組化合物極性大小。

ABC常見化學(xué)成分類型的極性

極性較大的：苷類、生物堿鹽、糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸、鞣質(zhì)、小分子有機酸、親水性色素。極性小的：游離生物堿、苷元、揮發(fā)油、樹脂、脂肪、大分子有機酸、親脂性色素。

以上不是絕對的，具體成分要具體分析。比如，有的苷類化合物極性很小，有的苷元極性很大。

一、溶劑提取的方法

浸漬法滲漉法煎煮法回流提取法連續(xù)回流提取法超聲法（不常用）浸漬法浸漬法：

也叫冷浸法。將藥材粗粉以適當(dāng)溶劑在常溫下浸泡。多以水類或稀醇為溶劑。適于成分遇熱易破壞或含多糖較多的中藥的提取。缺點為浸出效果較差，水提取液易發(fā)霉，提取液體積大，浸出時間長。滲漉法滲漉法：將中藥粗粉裝于滲漉筒中，不斷添加溶劑滲過藥粉，從滲瀘筒下端不斷流出滲瀘液。各類溶劑均可。此法由于溶液濃度差大，浸出效果好，且不破壞成分。但缺點為溶液體積大，時間長。提取效率高于浸漬法。煎煮法煎煮法：為中藥水提取最常用的方法。將中藥粗粉用水加熱煮沸，保持一定時間，成分即可浸出。煎煮法必須以水為溶劑。此法提取效率高，但遇熱破壞成分要注意。且含多糖多的成分過濾困難。回流提取法回流提取法：用于以有機溶劑加熱提取成分。優(yōu)點為提取效率高，但受熱易破壞成分不宜用此法。缺點為溶劑消耗量大，需回流設(shè)備，需幾次提取方可提取完全。連續(xù)回流提取法連續(xù)回流法：以索氏提取器（亦稱脂肪抽出器）回流提取。克服了回流法溶劑需要量大、需幾次提取的缺點。缺點為提取時間長，受熱破壞成分不能用此法。1、裝有藥物的濾紙筒3、溶劑蒸汽上升管4、虹吸回流管

提取方法溶劑操作提取效率使用范圍備注浸漬法水或有機溶劑不加熱效率低各類成分，尤遇熱不穩(wěn)定成分出膏率低，易發(fā)霉，需加防腐劑滲漉法有機溶劑不加熱——脂溶性成分消耗溶劑量大，費時長煎煮法水直火加熱——水溶性成分易揮發(fā)，熱不穩(wěn)定不宜用回流提取法有機溶劑水浴加熱——脂溶性成分熱不穩(wěn)定不宜用，溶劑量大連續(xù)回流提取法有機溶劑水浴加熱節(jié)省溶劑，效率最高親脂性較強成分用索氏提取器，時間長各種溶劑提取方法的優(yōu)缺點旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀二、水蒸氣蒸餾法

適于具有揮發(fā)性、可隨水蒸氣蒸餾不被破壞，與水不反應(yīng)、且與水分層的成分的提取。中藥中主要用于揮發(fā)油、某些揮發(fā)性生物堿、少數(shù)揮發(fā)性蒽醌苷元、香豆素苷元的提取。三、超臨界流體萃取法（SFE）

以超臨界流體作為萃取介質(zhì)的一種提取新技術(shù)。最常用的是二氧化碳超臨界萃取法，環(huán)保、成本低、提取分離一步完成。超臨界流體：處于臨界溫度（Tc）、臨界壓力（Pc）以上，介于氣體與液體之間的流體。密度與液體近似黏度與氣體近似對很多物質(zhì)有很強的溶解能力擴散系數(shù)是液體的100倍（不及氣體）超臨界流體萃取的原理主要是根據(jù)超臨界流體對物質(zhì)有很強的溶解能力，且改變溫度或壓力即可改變流體的密度、粘度和擴散系數(shù)，流體對物質(zhì)的溶解特性也隨之改變，因此，可將不同性質(zhì)的成分分段萃取或分步析出，達(dá)到萃取分離的目的。中藥提取常用的超臨界流體（二氧化碳）的優(yōu)點

1.臨界溫度（Tc=31.4）接近室溫,熱敏成分穩(wěn)定.2.臨界壓力（Pc=7.37MPa）不太高,易操作.

3.本身呈惰性，與化合物不反應(yīng).

4.價格便宜.二氧化碳-超臨界流體的溶解能力規(guī)律：在超臨界狀態(tài)下，CO2對不同溶質(zhì)的溶解能力差別很大。其取決于溶質(zhì)的極性、沸點、分子量。(1)對親脂性、低沸點成分溶解能力強，如揮發(fā)油、烴類、醚類、酯類等。(2)成分極性基團(tuán)（如OH、COOH）越多，越難提取。如糖類、氨基酸的萃取壓力要4×104Pa以上。(3)成分分子量越大，越難提取。超臨界流體萃取中藥成分的主要優(yōu)點1.可以在接近室溫下工作，防止熱敏成分的破壞或逸散。2.萃取過程幾乎不用有機溶劑，萃取物中無溶劑殘留，對環(huán)境無污染。3.提取效率高，節(jié)約能耗。超臨界流體萃取法的應(yīng)用超臨界流體萃取法始于20世紀(jì)50年代，到70年代末，該法廣泛應(yīng)用于煙草和食品工業(yè)，80年代以來，超臨界流體萃取技術(shù)在醫(yī)藥、化工、食品及環(huán)保等領(lǐng)域取得了迅速發(fā)展，特別是在中藥有效成分提取分離方面日益受到重視。目前主要用于萜類、揮發(fā)油、生物堿、黃酮、苯丙素、皂苷和芳香有機酸等成分的提取分離。在青蒿素浸膏、蛇床子浸膏、胡椒精油、肉豆蔻精油等的制備分離方面已達(dá)到產(chǎn)業(yè)化規(guī)模。四、升華法

中藥中的某些固體成分在受熱低于其熔點的溫度下，不經(jīng)液態(tài)直接成為氣態(tài)，經(jīng)冷卻后又成為固態(tài)，從而與中藥組織分離這種性質(zhì)稱為升華，這種提取方法稱為升華法。中藥成分有少量具有升華性，如游離羥基蒽醌類成分，一些小分子香豆素類，有機酸類成分等。

例如樟木中升華的樟腦（camphor），在《本草綱目》中已有詳細(xì)的記載，為世界上最早應(yīng)用升華法制取藥材有效成分的記述。五、壓榨法

機械壓力影響提取效率的因素提取的方式、溶劑的選擇：藥材的粉粹度：

藥粉越細(xì)、表面積越大，提取效率越高。但太細(xì)，藥粉對成分的吸附也越強。因此水提取宜用粗粉；用有機溶劑可細(xì)些,以20目為好。溫度、時間：一般提取時間長提出量大。但被提成分在細(xì)胞內(nèi)外溶解一旦平衡，時間長即無意義。一般熱水提以1/2-1h為宜，乙醇提1hr為宜。第二節(jié)

分離、純化方法分配系數(shù)的差異溶解度的差異吸附性的差別分子大小的差別離解程度的不同中藥化學(xué)成分經(jīng)提取濃縮后，得到的仍是含有多種成分的混合物，需選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑵渲兴鞣N成分逐一分開，并把所得單體加以精制純化，這一過程稱為分離。一、兩相溶劑萃取法原理：利用混合物中各成分在互不相溶的兩相溶劑中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離的方法。

各成分在兩相溶劑中分配系數(shù)相差越大，則分離效率越高。一般采用全量多次分配提高萃取效率。需要注意的是防止乳化。溶劑的選擇：

1、分離極性較大的成分，用正丁醇-水

2、分離中等極性成分，用乙酸乙酯-水

3、分離低極性成分，用氯仿（或乙醚、石油醚等）-水。所用裝置：分液漏斗、連續(xù)液-液萃取裝置、液滴逆流層析裝置。（1）系統(tǒng)溶劑萃取法

常用來粗級分離，是將總提物分散于水中，依次用石油醚（或環(huán)己烷）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別減壓回收溶劑得到相應(yīng)極性的成分。極性成分類型適宜溶劑強親脂性揮發(fā)油、脂肪油、苷元

石油醚脂溶性色素、甾醇

己烷親脂性苷元、生物堿、樹脂

乙醚醛、醇、酯、有機酸

氯仿小強心苷

氯仿-乙醇（2：1）中極性中黃酮苷

乙酸乙酯大皂苷、蒽醌苷

正丁醇親水性極性很大的苷、糖類

丙酮氨基酸、某些生物堿鹽

甲醇、乙醇強親水性蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、氨基酸

水果膠、糖類、、無機鹽類（2）連續(xù)萃取法

采用連續(xù)萃取器萃取。利用兩溶液比重不同自然分層和分散相液滴穿過連續(xù)相溶劑時發(fā)生傳質(zhì)。此法可克服用分液漏斗多次萃取操作的麻煩。（3）逆流連續(xù)萃取法

利用兩相溶劑比重不同可自然分層和分散液滴穿過連續(xù)相溶劑時發(fā)生傳質(zhì)的原理，用一根或數(shù)根萃取管制成逆流連續(xù)萃取裝置。管內(nèi)的瓷環(huán)，增加液滴上升的路程和在連續(xù)相中停留的時間，更重要的是上升的液滴因撞擊填充物而被分散，擴大了兩相溶劑萃取的接觸面積，使萃取更完全。（4）液滴逆流層析法（DCCC）

是在逆流分布法基礎(chǔ)上發(fā)展的高分離效能的逆流分布法，分離管有100-1000根，互相串聯(lián)，上行法時，分離管內(nèi)充滿重相作為固定液相，利用泵將輕相（移動相）帶著樣品液進(jìn)入分離管，形成液滴通過分離管，流出的移動相通過檢測，分部收集。用氮氣（N2）壓驅(qū)動移動相*溶劑萃取法中溶劑系統(tǒng)的選擇：

兩相溶劑不相混溶，混合物中各單一成分在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)差別越大越好。分離酸堿兩性化合物時，緩沖液是很好的溶劑。*操作注意：（1）先將兩相溶劑相互充分飽和。（2）采用等體積兩相溶劑的方式。（3）欲分離混合物的濃度不宜過高。二、沉淀法

沉淀法是在中藥提取液中加入某些試劑，與其中一些成分生成沉淀，或加入某些試劑后可降低一些成分在溶液中的溶解度而自溶液中析出的一種方法。

如果所需要分離獲得的成分生成沉淀，則沉淀反應(yīng)必須是可逆的；如果是不需要的成分，則將生成的沉淀除去，可以是不可逆的沉淀反應(yīng)。（1）水醇沉淀法（1）水提取醇沉淀法：于水提濃縮液中加入乙醇使含醇量達(dá)60%以上，可使多糖、蛋白質(zhì)等水溶性雜質(zhì)沉淀。（2）醇提取水沉淀法：于醇提取濃縮液中加入10倍量以上水，可使樹脂、葉綠素等脂溶性雜質(zhì)沉淀。（2）鉛鹽沉淀法

利用中性醋酸鉛或堿式醋酸鉛在水或稀醇溶液中能與許多物質(zhì)生成難溶的鉛鹽或絡(luò)鹽沉淀而分離的方法。1、中性醋酸鉛可沉淀具有鄰二酚羥基和羧基的酸性或酚性物質(zhì)成分；沉淀有機酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂、酸性皂甙、部分黃酮等2、堿式醋酸鉛的沉淀范圍較廣，可沉淀含酚羥基和羧基及中性皂苷等。脫鉛方法：1．通入硫化氫氣體法——分解并轉(zhuǎn)為不溶性硫化鉛而沉淀2．硫酸鹽或磷酸鹽——硫酸鉛、磷酸鉛沉淀3．陽離子交換樹脂法——脫鉛快而徹底（3）酸堿沉淀法

本法是利用某些成分在酸（或堿）中溶解，而在堿（或酸）中沉淀的性質(zhì)達(dá)到分離的方法。

1）酸提取堿沉淀：用于生物堿的提取分離。2）堿提取酸沉淀：用于酚、酸類成分和內(nèi)酯類成分的提取、分離。

（4）分級沉淀法

改變加入溶劑的極性或數(shù)量使沉淀逐步析出的方法。實例：

多糖、蛋白質(zhì)的水溶液，分次加乙醇，使含醇量逐步提高，則可得到分子量由大到小的多糖、蛋白質(zhì)皂苷的乙醇液，分次加入乙醚或乙醚-丙酮，可按極性從小到大逐步沉淀。（5）專屬試劑沉淀法

某些試劑能選擇性地沉淀某類成分，稱為專屬試劑沉淀法。實例：

1、雷氏銨鹽能與水溶性生物堿類（季銨堿）生成沉淀，可用于分離水溶性生物堿與其它生物堿

2、膽甾醇能和甾體皂苷沉淀，可使其與三萜皂苷分離

3、明膠能沉淀鞣質(zhì)，可用于分離或除去鞣質(zhì)等。（6）鹽析沉淀法

于中藥水提取液中加入某些無機鹽至一定濃度或達(dá)到飽和狀態(tài)，可使某些成分由于溶解度降低而沉淀析出。常用的無機鹽有NaCl、Na2SO4等。實例：三七的水提取液中加硫酸鎂至飽和狀態(tài)，三七皂甙乙即可沉淀析出自黃藤中提取掌葉防己堿，自三顆針中提取小檗堿在生產(chǎn)上都是用氯化鈉或硫酸按鹽析制備。三、結(jié)晶法

從非結(jié)晶狀物質(zhì)通過處理得到結(jié)晶狀物質(zhì)的過程稱為結(jié)晶。用反復(fù)結(jié)晶的方法，從不純的結(jié)晶制得較純結(jié)晶的過程稱為重結(jié)晶。二者從操作角度差別是起始物不同。結(jié)晶和重結(jié)晶操作：提取或分離物↓溶于選擇的溶劑，加熱成飽和溶液，過濾溶液↓放置（冷藏）析晶，過濾粗結(jié)晶↓重復(fù)上述操作（重結(jié)晶）結(jié)晶

結(jié)晶的原理與目的

原理：結(jié)晶法往往用于固體物質(zhì)的精制純化，是利用混合物中各成分對某種溶劑溶解度的差別，使單一成分以結(jié)晶狀態(tài)析出，從而達(dá)到分離目的。

目的：求得結(jié)晶并制備成單體純品，就成為鑒定天然藥物成分、研究其分子結(jié)構(gòu)重要的一步。結(jié)晶的具體操作1．除去雜質(zhì)

有少量或微量雜質(zhì)存在，也能阻礙或延緩結(jié)晶的形成。

a、選用溶劑溶出雜質(zhì)，或只溶出所需要的成分。b、可用少量活性炭等進(jìn)行脫色處理，以除去有色

雜質(zhì)。

c、可通過氧化鋁，硅膠或硅藻土短柱吸附處理后

，再進(jìn)行制備結(jié)晶。2．溶劑的選擇

a、合適的溶劑應(yīng)對欲分離的成分熱時溶解度大，冷時溶解度小，而對雜質(zhì)則冷熱溶解度一致

b、沸點要適中

c、不與被分離成分產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。3．結(jié)晶溶液的制備

制備結(jié)晶的溶液，需要制成過飽和的溶液。一般是應(yīng)用適量的溶劑在加溫的情況下，將化合物溶解再放置冷處。如果在室溫中可以析出結(jié)晶，就不一定放置于冰箱中，以免伴隨結(jié)晶析出更多的雜質(zhì)。

溫度：通常在加溫的情況下，溶解過濾，除雜，濃縮，放冷。最合適的結(jié)晶溫度5-10度。時間：

一般3~5天或更長時間。濃度：

一般是多一些溶劑，放置使其慢慢揮發(fā)到合適的濃度。

一般有效成分的含量越高，越易結(jié)晶。4.重結(jié)晶及分步結(jié)晶

在制備結(jié)晶時，最好在形成一批結(jié)晶后，立即傾出上層溶液，然后再放置以得到第二批結(jié)晶。晶態(tài)物質(zhì)可以用溶劑溶解再次結(jié)晶精制。這種方法稱為重結(jié)晶法。結(jié)晶經(jīng)重結(jié)晶后所得各部分母液，再經(jīng)處理又可分別得到第二批、第三批結(jié)晶。這種方法則稱為分步結(jié)晶法或分級結(jié)晶法。晶態(tài)物質(zhì)在一再結(jié)晶過程中，結(jié)晶的析出總是越來越快，純度也越來越高。5．結(jié)晶純度的判定（鑒定的初步依據(jù)）a．晶形和色澤

結(jié)晶性純凈物質(zhì)，一般具有一定的晶形和均勻的色澤。b．熔點和熔距

單體化合物還應(yīng)有一定的熔點和較小的熔距。如為純凈的化合物，重結(jié)晶前后的熔點應(yīng)該一致。

化合物結(jié)晶的形狀和熔點往往因所用溶劑不同而有差異。實例：

原托品堿在氯仿中形成棱往狀結(jié)晶，熔點207℃；在丙酮中則形成半球狀結(jié)晶，熔點203℃；在氯仿和丙酮混合溶劑中則形成以上兩種晶形的結(jié)晶。所以文獻(xiàn)中常在化合物的晶形、熔點之后注明所用溶劑。c．色譜分析法晶體純度的進(jìn)一步確認(rèn)，須采用色譜法，常用的有薄層色譜和紙色譜等。若某成分經(jīng)同一溶劑數(shù)次結(jié)晶，其晶形一致，色澤均勻，熔點一定且熔距較小，同時在薄層色譜或紙色譜上，經(jīng)數(shù)種不同展開劑系統(tǒng)鑒定，均得到一個斑點，一般可認(rèn)為是一個單體化合物。四、膜分離法

利用天然或人工合成的高分子膜，以外加壓力或化學(xué)位差為推動力，對混合物溶液進(jìn)行分離、分級、提純和富集的方法。反滲透、超濾、微濾、電滲析及傳統(tǒng)的透析法均為膜分離技術(shù)。

原理：

大分子不能透過膜而被截留，小分子能透過膜，使分子大小不同的物質(zhì)得到分離。

技術(shù)關(guān)鍵：

根據(jù)欲分離成分的具體情況選用規(guī)格適宜的過濾膜。

不同膜過濾被截留的分子大小有區(qū)別。如運用超濾，選用適當(dāng)規(guī)格的膜可實現(xiàn)對中藥提取液中多糖類、多肽類、蛋白質(zhì)類的截留分離。五、分餾法

利用混合組分中各成分的沸點不同而分離的一種方法。用于液體混合物的分離。適用于能夠完全互溶的液體混合物的分離，常用分餾法分離揮發(fā)油及一些液體生物堿。分離毒芹總堿：毒芹堿沸點為166-167℃羥基毒芹堿沸點為226℃，彼此相差較遠(yuǎn)，即可以利用沸點的不同進(jìn)行分餾。六、色譜法

色譜法（chromatography）又稱層析法，是一種分離和鑒定化合物的有效方法，其最大的優(yōu)點在于分離效能高、快速簡便。對一些結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似化合物的分離，用經(jīng)典的萃取法、沉淀法和結(jié)晶法等難以達(dá)到分離目的時，用色譜法往往可以收到很好的分離效果。

如中藥丹參的化學(xué)成分在30年代僅從中分離到3種脂溶性色素，分別稱為丹參酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（結(jié)晶法）。但以后進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)除丹參酮Ⅰ為純品外，Ⅱ、Ⅲ、均為混合結(jié)晶。此后通過各種層析方法，迄今已發(fā)現(xiàn)15種單體（其中有4種為我國首次發(fā)現(xiàn)）。層析法的基本原理：色譜法根據(jù)分離原理可分為：1、吸附色譜:組分對吸附劑吸附能力不同2、分配色譜:利用物質(zhì)在固定相和流動相之間分配系數(shù)不同而達(dá)到分離3、凝膠色譜:利用物質(zhì)分子的大小不同4、離子交換色譜：基于各成分解離度的不同而分離

通常又將一般的以流動相為氣體的稱為氣相層析，流動相為液體的稱為液相層析。1、吸附色譜法

原理：

利用同一種吸附劑對混合物中各種成分吸附能力的差異，而使各成分達(dá)到分離目的的色譜方法。應(yīng)用范圍：

特別適用于很多中等分子量的樣品（分子量小于1，000的低揮發(fā)性樣品）的分離，尤其是脂溶性成分一一般不適用于高分子量樣品如蛋白質(zhì)、多糖或離子型親水住化合物等的分離。

吸附色譜法的分離效果，完全由吸附劑，洗脫溶劑和被分離物質(zhì)的性質(zhì)決定。常用吸附劑

1）硅膠：原理：硅膠是一種多孔，中等極性的酸性吸附劑，吸附作用是由于顆粒表面有很多硅醇基，它可以和許多化合物形成氫鍵而具有一定的吸附作用吸附規(guī)律：化合物極性越大、吸附能力強（難洗脫）應(yīng)用：適用于中性或酸性成分的層析。

2）氧化鋁：原理：氧化鋁是中等極性的弱堿性吸附劑，化合物與氧化鋁表面形成氫鍵吸附規(guī)律：化合物極性越大、吸附能力強（難洗脫）應(yīng)用：氧化鋁有弱堿性，主要用于堿性或中性親脂性成分的分離，如生物堿、甾、萜類等成分；對于生物堿類的分離頗為理想。

3）活性炭：原理：活性炭是非極性吸附劑，對非極性物質(zhì)吸附強。吸附規(guī)律：活性炭的吸附作用，在水中最強，在有機溶劑中則較低弱。因此水的洗脫能力最弱，而有機溶劑則較強?；衔飿O性越小、對活性炭的吸附能力強

應(yīng)用：活性炭主要用于分離水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些甙。從稀水溶液中富集微量物質(zhì),脫色（脂溶性色素）

4）聚酰胺：原理：聚酰胺中的酰胺基可與酚羥基、羧基、羰基、硝基等形成氫鍵吸附。吸附規(guī)律：

①化合物中能形成氫鍵的基團(tuán)（酚羥基、羧基、羰基）越多，吸附越強②能形成氫鍵的基團(tuán)數(shù)目相同，處于對位和間位的吸附力強于鄰位的③芳香環(huán)和雙鍵多，吸附力強。應(yīng)用：適于分離黃酮、酚、醌類、有機酸及鞣質(zhì)，可使性質(zhì)極相近的化合物得到分離洗脫劑、展開劑

化合物被吸附劑吸附后，需用合適的溶劑進(jìn)行展開，這種溶劑稱為展開劑，在柱色譜中習(xí)慣稱為洗脫劑。展開劑在吸附色譜中主要作用是解吸附。在吸附色譜中，洗脫劑的洗脫能力與其極性有關(guān)。對于極性吸附劑（硅膠、氧化鋁），洗脫劑的極性越大，其洗脫能力越強，化合物在色譜中移動的速度就越快，而對非極性吸附劑（活性炭）則相反，洗脫劑的極性越小，其洗脫能力越強。被分離成分與吸附劑、洗脫劑共同構(gòu)成了吸附色譜中的三要素。

對硅膠、氧化鋁等極性吸附劑來說，對極性大的化合物吸附強，移動慢，Rf值??；而對極性小的化合物吸附弱，Rf值大，從而將各成分分離開。全面考慮吸附劑、展開劑和被分離成分三者的相互關(guān)系，是分離成敗的關(guān)鍵。被分離物質(zhì)吸附色譜法的操作方式1）薄層色譜：制板點樣展開顯色2）柱色譜：裝柱上樣洗脫收集濃縮檢識合并結(jié)晶（1）吸附薄層色譜法（TLC）此法是將吸附劑均勻地鋪在玻璃板上形成薄層，把欲分離的試樣溶液點加到薄層板的一端，然后用合適的展開劑展開，使混合物中各成分得以分離的方法。吸附薄層色譜的操作主要包括鋪板（制板）、點樣、展開和顯色四個方面。實際工作中常用硅膠-羧甲基纖維素鈉（硅膠CMC-Na）薄層板，展開方式有上行法、下行法、單向展開、雙向展開等多種。Rf

作為定性指標(biāo)將計算出的Rf值與已知化合物的Rf值對照，也可與文獻(xiàn)上記載的Rf值比較，進(jìn)行定性鑒別。TLC的應(yīng)用薄層色譜：

1、主要用于各類化學(xué)成分的預(yù)試驗、分離鑒定及探索柱色譜分離的條件

2、應(yīng)用于中草藥品種、藥材及其制劑真?zhèn)蔚臋z查、質(zhì)量控制和資源調(diào)查?！端幍洹芬徊坎捎帽由V法作鑒別的中藥材和中藥成方制劑品種已達(dá)1523種。（2）吸附柱色譜法

吸附柱色譜法是將試樣加入到一定規(guī)格裝有吸附劑的玻璃柱里，再用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摚菇Y(jié)構(gòu)性質(zhì)不同的成分達(dá)到分離的方法。其分離原理、吸附劑和洗脫劑的選擇均與吸附薄層色譜法基本相同。柱色譜的具體操作可分為裝柱、加樣和洗脫三步。柱色譜主要用于化學(xué)成分的分離制備及含量測定2、分配色譜法原理：

分配色譜的原理來自于兩相溶劑萃取法。利用被分離成分在固定相和流動相之間的分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離的方法。分類：按照固定相與流動相的極性差別，分配色譜法有正相與反相色譜法之分。正相色譜：固定相極性>流動相極性，用于分離極性和中等極性的成分。反相色譜：固定相極性<流動相極性（反相分配色譜法應(yīng)用廣泛）用于分離非極性和中等極性的成分反相分配色譜法固定相：常用的固定相有十八烷基硅烷（ODS）或C8鍵合相。在普通硅膠表面進(jìn)行化學(xué)修飾，鍵合上長度不同的烴基（R）形成親脂性表面，習(xí)稱鍵合相，如十八烷基或辛基硅烷鍵合相。中藥中的各種苷類特別適合用反相色譜法分離。流動相：常用甲醇-水或乙腈-水系統(tǒng)反相分配色譜法洗脫規(guī)律：反相色譜中，極性大的化合物先被洗脫，極性小的化合物后被洗脫3、離子交換色譜法

（ionexchange

chromatography）原理

樹脂與被交換成分間同種電荷離子的等當(dāng)量替代作用。以離子交換樹脂為固定相，水或酸水、堿水為流動相，在流動相中的離子性物質(zhì)與樹脂進(jìn)行交換而被吸附，再用適合溶劑將被交換成分從樹脂上洗脫下來即可。陽離子交換樹脂：強酸型R-SO3-H+

和弱酸型-COO-H+

。陰離子交換樹脂：強堿型RN+

(CH3)3CI-和弱堿型-NR2、

-

NHR、-NH2（伯、仲、叔胺）等。離子交換平衡式陽離子交換樹脂：陰離子交換樹脂：式中R－SO3—H+

、R－N+(CH3)3·OH-分別代表陽離子和陰離子交換樹脂，在水中可分別電離出H+和OH

-，其中H+與Na+交換，OH-與Cl

-交換，使反應(yīng)不斷地向右方向進(jìn)行，直至交換完全，而且這種交換反應(yīng)是可逆的。當(dāng)再分別用HCl和NaOH洗脫柱子時，反應(yīng)按逆方向進(jìn)行，將Na+和Cl

-分別洗脫交換下來。

離子交換色譜的應(yīng)用

離子交換色譜法主要用于能產(chǎn)生離子的成分分離。某些中藥成分具有酸性、堿性及兩性基團(tuán)，如有機酸、酚類、氨基酸、肽類、生物堿等，在水中多呈離解狀態(tài)，可用離子交換樹脂法進(jìn)行分離。中藥中的堿性成分可用陽離子交換樹脂交換,酚\酸性成分可用陰離子交換樹脂交換,然后將交換后的樹脂通過調(diào)整酸堿環(huán)境使吸附物游離,選擇適當(dāng)溶劑將吸附物溶解出即可。4、大孔樹脂吸附法

性能：大孔樹脂是一種不含交換基團(tuán)，具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。一般為白色顆粒，20-60目。理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機溶劑。大孔吸附樹脂的結(jié)構(gòu)中包含了許多微觀小球組成的網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)。水溶液中吸附力較強，且有很好的選擇性。原理：①吸附性：大孔吸附樹脂本身具有吸附性，是由范德華力或氫鍵吸附的結(jié)果。②分子篩原理：是由大孔吸附樹脂本身的多孔性所決定的。影響大孔吸附樹脂分離效果的因素①化合物分子極性大小：一般來說，大孔樹脂的色譜行為具有反相的性質(zhì)。被分離物質(zhì)的極性大先流出色譜柱。②分子體積大小：在一定條件下，化合物體積越大，吸附力越強。洗脫劑：對非極性大孔樹脂，洗脫劑極性越小，洗脫能力越強對中極性大孔樹脂及極性較大化合物，則極性較大溶劑洗脫力強。一般上樣后先用水（或酸、堿水）洗去雜質(zhì)，然后用不同濃度的含水醇、甲醇、乙醇、丙酮等依次洗脫。大孔吸附樹脂的應(yīng)用

（1）成分的類型與樹脂的選擇：（2）優(yōu)點：吸附容量大，選擇性好，成本低，收率較高，再生容易等優(yōu)點。在醫(yī)藥工業(yè)及工業(yè)廢水、廢液的凈化處理等方面都得到廣泛應(yīng)用。目前，大孔吸附樹脂在多糖、皂苷、黃酮、生物堿、三萜類化合物的分離方面都有很好的應(yīng)用實例。5、凝膠色譜法(分子排阻色譜法)

(gelfiltrationchromatography，GFC)

性能及分類:葡聚糖凝膠是葡聚糖和甘油，通過醚橋鍵相交而成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)。交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密，網(wǎng)孔越小，吸水膨脹就越大，可用于小分子量物質(zhì)的分離。反之，則用于大分子量物質(zhì)的分離。

常用的有葡聚糖凝膠（SephadexG）、羥丙基葡聚糖凝膠（SephadexLH-20）、聚丙烯酰胺凝膠（Sephacrylose,商品名Bio-gelP）及瓊脂糖凝膠（Sepharose,商品名Bio-GelA）等。交聯(lián)葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)

分離原理：（分子篩原理）

葡聚糖凝膠吸水后，形成凝膠粒子，在交鏈鍵的骨架中存在著許多網(wǎng)眼。當(dāng)混合物溶液通過凝膠柱時，比凝膠孔隙小的分子可以自由進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而比凝膠孔隙大的分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只能通過凝膠顆粒間隙。因此移動速率有差異，分子大的物質(zhì)不被遲滯(排阻)，保留時間則較短，分子小的物質(zhì)由于向孔隙溝擴散，移動被滯留，保留時間則較長，而達(dá)到分離。凝膠色譜的應(yīng)用凝膠色譜法在中藥化學(xué)成分的分離純化工作中被廣泛應(yīng)用，主要用于分離水溶性大分子化合物。尤其是一些如蛋白質(zhì)、酶、多肽、甾體、多糖、苷類等的分離，效果較好。另外還可用于脫鹽、吸水濃縮、除熱源及粗略測定高分子物質(zhì)的分子量等方面。氣相色譜法

（gaschromatography，GC）GC的基本原理

GC是以惰性氣體作為流動相，利用樣品中各個組分在色譜柱中的氣相和固定相間的分配系數(shù)不同，當(dāng)汽化后的試樣被載氣帶入色譜柱中運行時，組分就在其中的兩相間進(jìn)行反復(fù)多次（103-106）的分配（吸附－脫附－放出）由于固定相對各種組分的吸附能力不同（即保存作用不同）,因此各組份在色譜柱中的運行速度就不同，經(jīng)過一定的柱長后，便彼此分離，順序離開色譜柱進(jìn)入檢測器，產(chǎn)生的離子流信號經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組分的色譜峰。氣相色譜結(jié)構(gòu)流程

載氣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱檢測系統(tǒng)溫控系統(tǒng)色譜柱(分離柱)色譜柱:色譜儀的核心部件。柱材質(zhì):不銹鋼管或玻璃，內(nèi)徑3-6毫米。長度可根據(jù)需要確定。柱填料:粒度為60-80或80-100目的色譜固定相。應(yīng)用舉例

定量分析：a.色譜峰的測量:以峰的起點和終點的聯(lián)線作為峰底。從峰高極大值對時間鈾作垂線，對應(yīng)的時即為保留時間。從峰頂至峰底間的線段即為峰高。b.計算:由色譜峰量出各組分的峰高，然后在各自的校準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的待測物濃度。定性結(jié)果：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)譜圖各組分的保留時間確定被測試樣中出現(xiàn)的組分?jǐn)?shù)目和組分名稱。苯系物氣相色譜圖氣相色譜分析的主要特點

１．高效能．是指一般色譜柱都有幾千塊理論板，毛細(xì)管柱可達(dá)10５－10６塊理論班。因而可以分析沸點十分相近的組分，和極為復(fù)雜的多組份混合物。例如，用毛細(xì)管，可以分析輕油中150個組份。

２．高選擇性．是指固定相對性質(zhì)極為相似的組份，如同位素，烴類的異構(gòu)體等有較強的分離能力。主要通過選用高選擇性的固定液。３．高靈敏度．指用高靈敏度的檢測器可檢測出10-11－10-13克的物質(zhì)。因此可用于痕量分析。