1可食動(dòng)物肌肉和肝臟中利巴韋林及其代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物可食性組織中利巴韋林殘留量液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于可食動(dòng)物肌肉、肝臟中利巴韋林及其代謝物1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺殘留量的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3原理試樣中利巴韋林及其代謝物1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺采用1%乙酸-甲醇提取，經(jīng)乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和十八烷基硅烷（C18）分散凈化，濃縮定容后，超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。4試劑及標(biāo)準(zhǔn)液制備除非另有規(guī)定，以下試劑均為分析純。水符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)。4.1.2甲酸：色譜純。4.1.3乙酸銨：色譜純。4.1.4乙酸：色譜純。4.2標(biāo)準(zhǔn)品24.2.1利巴韋林，純度大于98.0%。4.2.21H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺（TCONH2），純度大于98.0%。4.2.313C5-利巴韋林（13C5-Ribavirin），純度大于99.0%。4.3溶液配制4.3.1100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取適量的利巴韋林和TCONH2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配制成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20℃下避光儲(chǔ)存，保存期1年。4.3.21mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確吸取1mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（4.3.1）于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻得到1mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，于-20℃下避光儲(chǔ)存，保存期6個(gè)月。4.3.3100mg/L內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取適量的13C5-利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配置成100mg/L的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20℃下避光儲(chǔ)存，保存期1年。4.3.41mg/L內(nèi)標(biāo)中間液：用移液管吸取內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（4.3.3）1mL于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻得到1mg/L的內(nèi)標(biāo)中間液，于-20℃下避光儲(chǔ)存，保存期6個(gè)月。4.3.5混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)每種標(biāo)準(zhǔn)的靈敏度和線性范圍，移取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（4.3.2）和內(nèi)標(biāo)中間液（4.3.4），用空白基質(zhì)稀釋至合適濃度，使用前現(xiàn)用現(xiàn)配。4.4材料4.4.1乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）。4.4.2十八烷基硅烷（C18）。4.4.3微孔濾膜（水相）0.22μm。5儀器和設(shè)備5.1超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（配電噴霧離子源）。5.3組織均質(zhì)器。5.4電子分析天平。5.5高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于5000r/min。5.6氮?dú)鈨x。5.7絞肉機(jī)。6試樣制備與保存6.1試樣的制備取動(dòng)物肌肉、肝臟樣品約500g用肉類組織搗碎機(jī)攪碎，裝入潔凈容器作為試樣，密封，并標(biāo)記注6.2試樣的保存將試樣于-20℃保存。37分析步驟稱取稱取1g（精確至0.01g）樣品于50mL聚乙烯管中，加入濃度為200μg/L的內(nèi)標(biāo)溶液50μL，加入5mL1%乙酸-甲醇（1:99，V/V）溶液，渦旋1min，在4500rpm下離心5min，取上清液待凈化。7.2凈化稱取50mgPSA和50mgC18吸附劑置于15mL離心管中，移取上清液（7.1）至此離心管中，渦旋30s，然后在4500r/min下離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，在45℃條件下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?mL初始流動(dòng)相溶解，放置1min，然后渦旋30s，經(jīng)0.22μm孔徑濾膜過(guò)濾后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。7.3液相色譜條件a）色譜柱：ZORBAXSB-Aq（100mm×3.0mm，1.8μm）。b）流動(dòng)相：流動(dòng)相A為2mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1％甲酸）；流動(dòng)相B為甲醇。c）流速：0.4mL/min。d）柱溫：35℃。e）進(jìn)樣體積：5.0μL。f）流動(dòng)相和梯度洗脫條件見(jiàn)表1。表1液相色譜梯度洗脫條件時(shí)間（min）流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B（%）002.503.52986.02987.007.4質(zhì)譜條件a）離子化模式：電噴霧電離正離子模式（ESI+）。b）毛細(xì)管電壓：3000V。c）干燥氣溫度：150℃。d）干燥氣流量：15L/min。e）霧化氣壓力：35psi。f）鞘氣溫度：300℃。g）鞘氣流量：11L/min。4h）檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），監(jiān)測(cè)條件見(jiàn)表2。表2利巴韋林、TCONH2和13C5-利巴韋林質(zhì)譜參數(shù)保留時(shí)間母離子子離子駐留時(shí)間碎裂電壓/v碰撞能/ev380利巴韋林2.472459696*3803803020TCONH22.28693802513C5-Ribavirin2.472503808注：*為定量離子對(duì)。7.5定性測(cè)定被測(cè)組分選擇1個(gè)母離子，2個(gè)以上子離子，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)液的保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)；且樣品譜圖中各組分定性離子的相對(duì)豐度與濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液譜圖中對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，偏差不超過(guò)表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。表3定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度/%>50>20~50>10~20≤10允許的最大偏差/%±20±25±30±507.6定量測(cè)定內(nèi)標(biāo)法定量：用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣，以分析化合物和內(nèi)標(biāo)化合物的峰面積比為縱坐標(biāo)，以分析化合物和內(nèi)標(biāo)化合物的濃度比為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測(cè)工作液中Ribavirin和TCONH2的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi)，色譜圖參見(jiàn)附錄A。7.7回收率陰性樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照7.1-7.2操作，測(cè)定后計(jì)算樣品添加的回收率，不同基質(zhì)中利巴韋林和TCONH2殘留量在不同添加水平的回收率數(shù)據(jù)參見(jiàn)附錄B。7.8精密度陰性樣品中添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照7.1-7.2操作，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，日內(nèi)精密度與日間精密度結(jié)果見(jiàn)附錄B中的表B.2。7.9檢出限和定量限5本方法檢出限：肌肉中利巴韋林及其代謝物1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺的檢出限為0.05μg/kg；肝臟中利巴韋林及其代謝物1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺的檢出限為0.1μg/kg。本方法定量限：肌肉中利巴韋林及其代謝物1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺的定量限為0.2μg/kg；肝臟中利巴韋林及其代謝物1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺的定量限為0.5μg/kg。8結(jié)果計(jì)算試樣中利巴韋林和TCONH2的殘留量按式（1）計(jì)算，計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。式中：X——樣品中利巴韋林或TCONH2殘留量(μg/kg)；Cs——利巴韋林或TCONH2標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度(μg/L)；Csi——利巴韋林或TCONH2標(biāo)準(zhǔn)工作液中內(nèi)標(biāo)物13C5-利巴韋林的濃度(μg/L)；Ci——試液中內(nèi)標(biāo)物13C5-利巴韋林的濃度(μg/L)；As——利巴韋林或TCONH2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積；A——樣品中利巴韋林或TCONH2的峰面積；Asi——利巴韋林或TCONH2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物利巴韋林或TCONH2的峰面積；Ai——樣品中13C5-利巴韋林的峰面積；V——樣品定容體積(mL)；m——樣品稱樣量(g)。6（資料性附錄）色譜圖肉雞兩種組織中利巴韋林和1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺（TCONH2）多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖，見(jiàn)圖A.1-A.6圖A.1空白肌肉多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖RBV圖A.2空白肌肉+利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品（10μg/kg）多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖TCONH2圖A.3空白肌肉+TCONH2標(biāo)準(zhǔn)品（10μg/kg）多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖圖A.4空白肝臟多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖RBV圖A.5空白肝臟+利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品（10μg/kg）多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖TCONH2圖A.6空白肝臟+TCONH2標(biāo)準(zhǔn)品（10μg/kg）多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖8附錄B（資料性附錄）回收率肌肉和肝臟中利巴韋林和1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺添加濃度及平均回收率的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，見(jiàn)表B.1。表B.1肌肉和肝臟中利巴韋林和1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（N=6）組織分析物添加濃度(μg/kg）平均回收率，%RSD，%肌肉利巴韋林1H-1,2,4-三氮唑利巴韋林0.55.00.55.00.55.0104.35108.36104.63106.21107.85102.84109.28102.247.896.684.756.323.584.263.695.254.87肝臟1H-1,2,4-三氮唑0.55.0104.482.364.853.969精密度肌肉和肝臟中利巴韋林和1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺添加濃度及平均回收率的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，見(jiàn)表B.2表B.2