臨床微生物學(xué)

ClinicalMicrobiologyMICROBIOLOGYStudyofmicroorganisms:visiblethroughamicroscopeSizeinμm(10-6m)

MICROORGANISMSPATHOLOGYEXEMPLES?

BACTERIAUrinaryinfections,DiarrheaTuberculosis,Diphtheria,Tetanus?

MOLDSMycosis,Tinea?

VIRUSAids,HepatitisC,Rubella?

PARASITESToxoplasmosis,Malaria,Tenia(tapeworm)WHERE?SoilAirWaterFoodINTHEENVIRONMENT:PATHOGENICITYObligatepathogenicbacteria:MultiplicationanddisseminationwithintheorganismResistancetoimmunesystemEnzymesecretion:lesionsinhosttissuesOccasionaltoxinsecretionsINSICKPEOPLE:PATHOGENICITY

Bacteriadonotleavethesiteofinfectionanditisthetoxinwhichspreadsthroughouttheorganismandcausesdisease

Eg: -Clostridiumtetani(tetanus) -Corynebacteriumdiphteriae(diphtheria)

Foodpoisoning: -Staphylococcusaureus -Clostridiumbotulinum

Botulism:ingestionoffoodinwhichC.botulinumhasdevelopedatoxin(noteliminatedinthedigestivetract)paralysisafterneuromuscularattack

Toxigenicbacteria

Opportunisticpathogenicbacteria:

Whichbacteria? Saprophyticbacteriaorfromnormalflora Usuallynonpathogenic When?ImmunodepressioninhostRuptureofnaturalbarrier

Ex:E.coli,presentinnormalfloraandsometimescauses urinaryinfections,septicemia...PATHOGENICITYWHERE?YESMouthEarsRespiratorytractIntestinaltractGenitaltractSkin....NOBloodCerebro-spinal-fluid(CSF)UrineINHEALTHYPEOPLENormalFlora:conwithenvironmentAlwayssterile:closedcavitiesTHECLINICALBACTERIOLOGYLABTHEAIMFindtherighttreatmentforthepatient?HOW?IsolatethebacteriaresponsiblefortheinfectionIdentifythisbacteriaTestitsresistancetodifferentantibioticsDIFFERENTSTEPSOF

BACTERIOLOGICALDIAGNOSISSpecimencollectionMicroscopicexaminationCultureIdentificationSusceptibilitytesting標(biāo)本采集和運(yùn)送是細(xì)菌培養(yǎng)成功的最最重要的關(guān)鍵！但由于標(biāo)本的采集和運(yùn)送常有護(hù)士或醫(yī)生或病人自己完成,所以也是最不容易做好的事情，而且不知道問(wèn)題所在之處，由此引發(fā)的最主要后果是陽(yáng)性率下降，這也是臨床醫(yī)生最不能接受的問(wèn)題，SPECIMENCOLLECTION標(biāo)本收集、運(yùn)送及處理注意事項(xiàng)：

1、收集真正病灶處的標(biāo)本，且不得受到鄰近區(qū)域微生物的污染

2、不要在標(biāo)本中添加任何防腐劑，以免影響有意義的致病菌的分離。

3、立即（2h內(nèi)）把標(biāo)本送到細(xì)菌試驗(yàn)室，不可拖延。防止部分苛養(yǎng)菌死亡以及標(biāo)本中正常菌群繁殖而影響致病菌分離。應(yīng)注明標(biāo)本收集時(shí)間。

4、盡可能在病人服用抗菌藥或傷口局部處理之前收集標(biāo)本。若已服用抗菌藥物，應(yīng)記錄于申請(qǐng)單上。

5、在檢驗(yàn)申請(qǐng)單上醫(yī)生應(yīng)提供患者的臨床資料，以協(xié)助檢驗(yàn)醫(yī)師選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境。SPECIMEN

COLLECTION

Multimicrobialspecimens:

Specimens: cutaneous digestive vaginal,urethral respiratorytract... ObservationofmanydifferentbacteriaMonomicrobialspecimens:

Specimens:

CSF,blood,urine Observationofonebacteriaonly

Pathogenicagentonly

NormalFlora+PathologicAgent常見(jiàn)臨床標(biāo)本的微生物學(xué)檢查血培養(yǎng)的臨床意義敗血癥是一個(gè)非常嚴(yán)重的問(wèn)題.死亡率高血液中的微生物在3分鐘內(nèi)到達(dá)每個(gè)器官.

血培養(yǎng)是最好的工具幫助它們用藥、減少死亡率Septicemia微生物或其產(chǎn)物在血液中引起疾病1.啟動(dòng)抗生素治療前采集血培養(yǎng)標(biāo)本苛氧菌例如：HACEK群細(xì)菌包括嗜血桿菌屬、伴放線(xiàn)凝聚桿菌、心桿菌屬、

艾肯菌屬、金桿菌屬急診

2.采血量最關(guān)鍵，而非采血時(shí)機(jī)對(duì)于檢測(cè)膿毒癥的病原菌來(lái)說(shuō)，抽足量的血樣本比抽血時(shí)間更重要。

10毫升/瓶循環(huán)的CFU/mlvs.病原體成人(>12歲):<1CFU/ml金黃色葡萄球菌27%銅綠假單胞菌55%大腸埃希菌62%所有菌種40%FromMayoClinic,BostonCityHosp.,NationalChildrens’Hosp.,Univ.ofWashington,Seattle.3.正規(guī)血培養(yǎng)要以”套”采血成人每個(gè)膿毒癥病程需抽2-4套血培養(yǎng)需氧瓶+

厭氧瓶為一套兩套指兩個(gè)采血部位（不同靜脈穿刺點(diǎn)）FA+FN對(duì)已經(jīng)使用抗菌藥物治療的患者用含活性炭的抗菌藥物吸附瓶SA+SN未使用抗菌藥物治療的患者用標(biāo)準(zhǔn)血培養(yǎng)瓶RileyJ.A.,HeiterB.J.,BourbeauO.O.ComparisonofrecoveryofbloodcultureisolatesfromtwoBacT/ALERTFANaerobicbloodculturebottleswithrecoveryfromoneFANaerobicbottleandoneFANanaerobicbottle.JClinMicrobiol.2003;41:213-217

接種厭氧血培養(yǎng)瓶的意義與單獨(dú)只進(jìn)行需氧瓶培養(yǎng)相比，需氧和厭氧瓶搭配培養(yǎng)可以檢出更多的葡萄球菌、肺炎鏈球菌、腸桿菌科細(xì)菌和厭氧菌。4.皮膚消毒靜脈穿刺部位的消毒：

成人、>2月小兒選用葡萄糖酸氯己啶（chlorhexidinegluconate，CHG）或2％碘酊。<2月時(shí)不推薦葡萄糖酸氯己啶。隨著時(shí)間推移敗血癥病原菌的變遷%住院患者血培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果#1

pathogenFromUW,MadisonandG.WashingtonUniv.,St.Louis皮膚不是無(wú)菌的;定植細(xì)菌“污染”血培養(yǎng)血培養(yǎng)存在的主要問(wèn)題如果皮膚定植的細(xì)菌沒(méi)有被殺死，這些細(xì)菌將通過(guò)針頭被吸入血培養(yǎng)瓶并在瓶中生長(zhǎng)這些細(xì)菌(主要為凝固酶陰性葡萄球菌)引起導(dǎo)管相關(guān)性敗血癥(住院患者血培養(yǎng)第一位)醫(yī)生不能將真的凝固酶葡萄球菌感染和皮膚定植菌“污染”相區(qū)分，因此他們用萬(wàn)古霉素治療患者污染細(xì)菌血培養(yǎng)污染定義為在幾次血培養(yǎng)中單個(gè)血培養(yǎng)下列細(xì)菌陽(yáng)性:凝固酶陰性葡萄球菌棒狀桿菌微球菌丙酸桿菌芽孢桿菌5.血培養(yǎng)的污染率

通過(guò)靜脈穿刺，由皮膚定植菌可引起的污染。污染率至少應(yīng)控制3%以下。當(dāng)污染率增加時(shí)，應(yīng)該單獨(dú)計(jì)算出每一位采血者及每一個(gè)病區(qū)的污染率，有針對(duì)性地對(duì)臨床護(hù)士進(jìn)行培訓(xùn)?？傊梢酝ㄟ^(guò)適當(dāng)?shù)钠つw和瓶蓋消毒，從靜脈穿刺取血，并通過(guò)培訓(xùn)和干預(yù)措施等來(lái)防止污染。6.患者血管內(nèi)導(dǎo)管采集血液

經(jīng)插管采集的血液污染（假陽(yáng)性）風(fēng)險(xiǎn)高

可以通過(guò)定量培養(yǎng)或差異報(bào)警時(shí)間（自動(dòng)化血培養(yǎng)儀），比較患者血管內(nèi)導(dǎo)管抽血培養(yǎng)結(jié)果與外周血培養(yǎng)結(jié)果，來(lái)判斷是否為導(dǎo)管相關(guān)性血流感染。BothBloodCulturesmustbedrawnat thesametimeDifferentialTTP（DTTP）差異報(bào)警時(shí)間7.導(dǎo)管尖端培養(yǎng)如果沒(méi)有配套的經(jīng)皮穿刺靜脈血培養(yǎng)，不要送檢導(dǎo)管尖端培養(yǎng)。血標(biāo)本的收集注意事項(xiàng)血培養(yǎng)瓶常溫保存，不要冷藏。接種標(biāo)本后請(qǐng)立即送到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。如果是夜班采集標(biāo)本，可以放室溫保存（不要冷藏或者放到孵箱內(nèi)）。腦脊髓液微生物學(xué)檢查標(biāo)本采集：

通過(guò)腰椎穿刺術(shù)以無(wú)菌手續(xù)收集3—5ml于無(wú)菌小瓶或無(wú)菌試管中。一般采用第二管CSF做微生物培養(yǎng)。收集CSF后在常溫下15分鐘內(nèi)必須送到實(shí)驗(yàn)室。

注意事項(xiàng)

CSF切勿放入冰箱，否則會(huì)使致病菌死亡當(dāng)CSF收集量少時(shí)，應(yīng)首先做微生物學(xué)檢查，再做其他檢查，以免標(biāo)本被污染。應(yīng)在用抗菌藥物之前采集標(biāo)本漿膜腔積液的微生物學(xué)檢查標(biāo)本采集：

漿膜腔積液包括胸腔積液或胸水、腹腔積液或腹水、心包腔積液、關(guān)節(jié)腔積液、鞘膜腔積液等。多因漿膜腔發(fā)生循環(huán)障礙、炎癥、癌浸潤(rùn)等病變，腔內(nèi)液體滲漏增加所致。一般由臨床醫(yī)師在無(wú)菌操作下穿刺抽取，8—10ml于血培養(yǎng)瓶中。尿道感染每年850萬(wàn)例尿路感染,90%為女性1/2.5個(gè)婦女在一生中會(huì)得UTI下行性感染：血流腎臟膀胱（金黃色葡萄球菌，酵母菌，結(jié)核分枝桿菌）上行性感染：尿道膀胱腎盂血流尿液的微生物學(xué)檢查標(biāo)本采集1、中段尿：是臨床上最多采用的方法，簡(jiǎn)單易行，無(wú)感染的危險(xiǎn)。但不適用厭氧菌培養(yǎng)。2、腎盂尿采集法3、恥骨上膀胱穿刺術(shù)尿液的微生物學(xué)檢查尿細(xì)菌計(jì)數(shù)是診斷泌尿系感染的細(xì)菌學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，一般認(rèn)為，革蘭陽(yáng)性菌含菌數(shù)每毫升≧104CFU/ml，革蘭陰性菌含菌數(shù)每毫升≧105CFU/ml

可以肯定為感染。還應(yīng)與尿常規(guī)結(jié)果進(jìn)行分析。尿路感染病原菌糞便微生物學(xué)檢查標(biāo)本采集：

1、自然排便采集法

2、直腸試子法PATHOGENICITY:–EnterobacteriaceaeEnterococciYeastsAnaerobes...Salmonella,ShigellaE.coli,Yersinia,CampylobacterVibriocholeraeToxin:Clostridium,S.aureusDIGESTIVETRACT:PATHOGENICBACTERIA

NORMALFLORA膿性分泌物微生物學(xué)檢查標(biāo)本采集1、開(kāi)放性感染和已破潰的化膿灶：標(biāo)本采集前先用滅菌生理鹽水沖洗表面污染菌，再用棉試子蘸取或注射器吸取膿性分泌物2、感染與體腔或外界相同的部位3、閉鎖性膿腫厭氧培養(yǎng)標(biāo)本

1.痰標(biāo)本的厭氧培養(yǎng)標(biāo)本采集：必須用氣管穿刺法獲得痰液，從口腔吐出的痰標(biāo)本不能用于厭氧培養(yǎng)。2.尿標(biāo)本的厭氧培養(yǎng)標(biāo)本采集：恥骨上膀胱穿刺獲得尿標(biāo)本可用于厭氧菌培養(yǎng)3．便標(biāo)本厭氧培養(yǎng)標(biāo)本采集：可用排出的便做厭氧培養(yǎng)但也應(yīng)少與空氣接觸。

4.膿性分泌物：深部和粘膜附近的感染應(yīng)同時(shí)做厭氧菌培養(yǎng)和需氧菌培養(yǎng)直接鏡檢可以快速了解標(biāo)本中有菌和大致菌量初步判斷是否存在優(yōu)勢(shì)致病菌，還可以根據(jù)其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色性對(duì)病原菌進(jìn)行初步分類(lèi)并提供診斷思路：厭氧菌引起的傷口感染、便涂片菌群失調(diào)、痰涂片是否為合格標(biāo)本等。對(duì)于某些致病菌，標(biāo)本涂片鏡檢具有重要的早期診斷意義：TBMICROSCOPICEXAMINATIONMOTILITY1-

Noflagellum:

non-motileBacteria

3-

Manyflagella:

motilebacteria Motion:2-

Oneflagellum:

motilebacteria Motion:

Gram+VioletGram-Pink2-GRAMSTAININGThemostcommonlyusedstainingtechniqueinbacteriology

Usedtoclassifybacteria

MICROSCOPICEXAMINATION:SHAPECOCCIBACILLICOCCO-BACILLICHARACTERISTICSOFGROUPINGCOCCIBACILLIdiplococcichainsclustersdiplobacillicoccobacilli結(jié)核分枝桿菌：抗酸染色腦脊液墨汁染色NutrientagarRightatmosphereRighttemperatureToobtainbacterialgrowth,itisnecessaryto:Meettherequirementsofbacteria:CULTURE培養(yǎng)基的選擇

根據(jù)目的分類(lèi)：

1、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：加入了營(yíng)養(yǎng)成分，如血液等，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)要求高的細(xì)菌生長(zhǎng)（肺炎鏈球菌）。

2、選擇性培養(yǎng)基：某種特殊化學(xué)物質(zhì)，能阻止一類(lèi)細(xì)菌生長(zhǎng)但不影響另一類(lèi)細(xì)菌繁殖。（EMB抑制革蘭陽(yáng)性菌生長(zhǎng)）

3、鑒別培養(yǎng)基：加入某種特殊化學(xué)物質(zhì)，使生長(zhǎng)的細(xì)菌呈現(xiàn)不同顏色。（乳糖發(fā)酵陽(yáng)性大腸埃希菌在SS上呈現(xiàn)粉紅色菌落，志賀菌無(wú)色）

4、增菌培養(yǎng)基：含有特殊成分適合分離菌生長(zhǎng)，不適合其它菌生長(zhǎng)，通常用于標(biāo)本細(xì)菌數(shù)量少、生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌。（堿性蛋白胨水能讓霍亂弧菌繁殖，其它菌生長(zhǎng)不良）MULTIPLICATIONMultiplicationratedependsontemperature:Temperature37°C4°C65°CSpeed 1-aerobes Requirethepresenceofoxygen Theirenergyisobtainedbyusingoxygenintheair:Respiration(oxidativemetabolism)

eg:Pseudomonas,Mycobacteria，Enterobacteriaceae

CULTURE

2-anaerobes Canonlydevelopintheabsenceofair.Oxygenistoxicforthistypeofbacteria.Alltheenergyproducedcomesfromfermentation(fermentativemetabolism).

eg:Fusobacterium,Eubacterium

3-Microaerophilicbacteria

PreferaO2reducedatmosphere.

eg:Campylobacter,Mycoplasma

4-Capnophilicbacteria SomebacteriapreferaCO2-enrichedatmosphere,itisessentialforothers.

eg:NeisseriagonorrhoeaeCULTURECULTURE1234Time

Bacterialconcentration?Bacterialgrowth

phases24Hrs48HrsIDENTIFICATIONIsolation1432IDENTIFICATION?

Secondstep:IDENTIFICATIONBacteriaareclassifiedaccordingto:Family GenusSpecies

example:

Enterobacteriaceae

Escherichia

coli

IDENTIFICATIONOFBACTERIAE.coliOrientationtestsresults:-Morphology -Gram -Catalase,oxidase willdefinethefamilyorgenus,andenableyoutochoosethecorrectidentificationstripExamples:

Cocci,Gram+,Catalase+è

StaphylococciCocci,Gram+,Catalase- è

StreptococciBacilli,Gram-,Oxidase-è

EnterobacteriaceaeIDENTIFICATIONOFBACTERIAApplicationsIdentificationmediaintubesIdentificationstrips e.g.:APIstrips,ID32, VITEK1/2cardsIDENTIFICATIONOFBACTERIAchromIDMRSAchromIDESBLchromIDVREchromIDC.difficleIdentificationonchromogenicmedia:Interest:timeandmoneysavedIDENTIFICATIONOFBACTERIA?

Studyofantigeniccharacteristics immunologicreaction:antigen-antibody Antibodiesfixedonlatexparticles Slideagglutinationinpresenceofthecorrespondingantigen(bacteria...) -usingisolatedcolonies -ordirectlyusingthespecimens.Advantage:rapidity(immediatereaction)

latexwithantibodiesAGGLUTINATIONbacteria?Identificationusingmolecularbiology: IdentificationofbacteriabyaspecificDNAfragmentusingcoloniesordirectlyusingthespecimen

eg:GenProbe

Mycobacteria,Gonococci,Chlamydia...

Interest:Specificity,timesavingIDENTIFICATIONOFBACTERIAAdd1.0μlmatrixsolutionMALDI-TOFMS

SystemWorkflowStep1Step2Step3Airdryfor1-2min.Step4LoadStep5CreatespectraTargetslideNOTE:Othersampletypes:sedimentfrompositivebloodculturessedimentfromcertainspecimen(e.g.urines)Bacteria,molds,yeasts,mycobacteriaLaser樣品靶板細(xì)菌與基質(zhì)飛行管檢測(cè)器質(zhì)譜圖真空系統(tǒng)樣品靶板入口幾秒鐘即可得到結(jié)果基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)每個(gè)樣品測(cè)定時(shí)間僅需幾秒，算上預(yù)處理樣品，每小時(shí)可測(cè)~

150個(gè)樣品Mycobacteriumbutyricum丁酸分枝桿菌MALDI

Biotyper微生物快速鑒定與分類(lèi) ——操作簡(jiǎn)單、快速1.幫助臨床醫(yī)師選擇最佳藥物治療，避免由于抗生素使用不當(dāng)造成的不良后果2.進(jìn)行細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)，了解本醫(yī)院、本地區(qū)及全國(guó)某種致病菌的耐藥性變遷情況，以便采取有效措施，防止細(xì)菌耐藥的發(fā)生和發(fā)展。3.根據(jù)細(xì)菌對(duì)各種抗生素的敏感譜，對(duì)被測(cè)菌進(jìn)行鑒定。

Recover

quickly抗微生物藥物敏感試驗(yàn)

AntimicrobialSusceptibilityTests(AST)SUSCEPTIBILITYTESTING:

CLSI(clinicalandlaboratorystandardsinstitute)推薦的方法:

體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)

SUSCEPTIBILITYTESTINGSusceptiblebacteria:SBacteriadonotgrowinthepresenceoftheantibioticTreatmentwiththisantibioticwillbesuccessfulResistantbacteria:RBacteriagrowinthepresenceoftheantibioticTreatmentwiththisantibioticwillbeafailureIntermediatebacteria:IIntermediateresult2014Susceptible-dosedependent:SDD

指依賴(lài)于患者所用劑量的菌株敏感性。當(dāng)菌株的藥敏結(jié)果(MIC或紙片擴(kuò)散法)在“SDD”范圍時(shí)，臨床應(yīng)提高給藥方案[如更高劑量和(或)更頻繁給藥]，以達(dá)到臨床療效。RESULTSSUSCEPTIBILITYTESTINGK-B法，紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauermethod,Diskdiffusionmethod）MIC:ug/mlDIFFER