通過(guò)擴(kuò)增青霉素生物合成基因簇

提高產(chǎn)黃青霉在固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵中的

青霉素產(chǎn)量WorldJMicrobiol

Biotechnol(2008)第二組青霉素次級(jí)代謝殺菌影響青霉素產(chǎn)量高低隨機(jī)突變基因工程優(yōu)化基因過(guò)表達(dá)結(jié)構(gòu)基因(pcbAB,pcbC和penDE)

構(gòu)巢曲霉（Aspergillus

nidulans）產(chǎn)黃青霉（Penicillium

chrysogenum）

pcbC和penDE

pcbAB整個(gè)的基因簇pcbAB–pcbC–penDE

上述研究均是利用產(chǎn)黃青霉Wis54-1255完成的，Wis54-1255僅含有一個(gè)青霉素基因簇的拷貝并且只能產(chǎn)生少量的抗菌素，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果只適用于液態(tài)發(fā)酵。本實(shí)驗(yàn)中，研究者對(duì)比了在轉(zhuǎn)入整個(gè)青霉素基因簇后低產(chǎn)菌株（Wis54-1255）和高產(chǎn)菌株（P2-32）青霉素產(chǎn)量的差別，并且首次應(yīng)用此法檢測(cè)轉(zhuǎn)化菌株在新興的固態(tài)發(fā)酵（SSF）技術(shù)（Suryanarayan2003;Barrios-Gonza′lezand

Mej?′a2007）中的反應(yīng)。材料和方法產(chǎn)黃青霉Wis54-1255——青霉素低產(chǎn)菌株產(chǎn)黃青霉Wis54-1255npe10——其青霉素基因簇不完整產(chǎn)黃青霉P2-32——青霉素高產(chǎn)菌株可容納青霉素基因簇以串聯(lián)重復(fù)的方式擴(kuò)增數(shù)倍產(chǎn)黃青霉NRRL1951（野生型）——用作基因文庫(kù)的DNA源枯草芽孢桿菌ATCC6633——用于在生物測(cè)定中評(píng)估青霉素G的產(chǎn)量大腸桿菌DH5a——用于粘性質(zhì)?；蛭膸?kù)和一般基因操作的受體菌株材料和方法質(zhì)粒載體cos區(qū)多克隆位點(diǎn)腐草霉素抗性基因位點(diǎn)（基因ble）——作為真菌選擇標(biāo)記刪除PstI和XbaI的限制性酶切位點(diǎn)IztapaCos

基因組文庫(kù)的構(gòu)建野生型NRRL1951IztapaCos載體全部DNA提取Sau3A1部分消化去磷酸化材料和方法BamHI-XbaI消化連接材料和方法基因組文庫(kù)的篩選pbcAB探針penDE探針【通過(guò)PCR方法獲得】以TGACAGACTATGTGGGTCTAGACCT和CGCTGTAAAGGTAACGCTCTTAAGG為引物，并包括基因pcbAB編碼區(qū)的3’末端序列和3’-UTR的起始序列【由HindIII酶切質(zhì)粒pULJL33而獲得】大小為0.3kb，包含基因penDE的3’末端序列通過(guò)切口轉(zhuǎn)移標(biāo)記上α-32P-dCTP于暗盒中在-70oC條件下用Hiperfilm-MP膠片曝光1小時(shí)30000cfu/dish副本材料和方法真菌的轉(zhuǎn)化E.coli30–80μg/ml的梯度培養(yǎng)基30–80μg/ml的梯度培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化菌株轉(zhuǎn)化菌株30μg/ml腐草霉素30μg/ml腐草霉素30μg/ml腐草霉素Wis54-1255npe10Wis54-1255P2-32堿裂解40kbp粘性質(zhì)?；D(zhuǎn)篩選對(duì)照材料和方法青霉素在瓊脂上的產(chǎn)量Somerson培養(yǎng)基制成的瓊脂塊（g/l,乳糖110，葡萄糖14，CaCO320，KH2PO46，MgSO4?7H2O6，谷物浸提液70，苯乙酸1.4）接種了枯草芽孢桿菌的胰蛋白胨（1%瓊脂）培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化菌株的菌絲體材料和方法液態(tài)發(fā)酵含有50ml復(fù)合生長(zhǎng)培養(yǎng)基25oC,50rpm培養(yǎng)36小時(shí)取各菌株的孢子接種（1×106）每隔一定時(shí)間，取5毫升培養(yǎng)物含有45ml復(fù)合生產(chǎn)培養(yǎng)基25oC,250rpm培養(yǎng)144小時(shí)轉(zhuǎn)接作為副本材料和方法固態(tài)發(fā)酵經(jīng)過(guò)0.3-0.6mm孔徑篩過(guò)的甘蔗渣改良的Somerson復(fù)合生產(chǎn)培養(yǎng)基接種（2×106孢子/ml）初始的水分含量設(shè)定為70%在每個(gè)Raimbault型圓柱發(fā)酵罐中加入12g固體培養(yǎng)基25oC條件下進(jìn)行144小時(shí)，通氣量設(shè)定為2.4L/h取出并混勻圓形容器中的內(nèi)容物取1克潮濕的培養(yǎng)基樣品測(cè)定其pH值和青霉素含量1700rpm離心20分鐘，青霉素被抽提到0.1M的磷酸緩沖液中從而使樣品的pH值為5.5（如果有必要可加入H3PO4調(diào)節(jié)pH值）。取60微升提取物或其稀釋物用于生物鑒定。材料和方法數(shù)據(jù)分析對(duì)于固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，樣品（整個(gè)培養(yǎng)瓶或圓柱發(fā)酵罐）為一式三份。對(duì)原始和轉(zhuǎn)化菌株的青霉素產(chǎn)量采用Student’sT-test方法進(jìn)行分析。結(jié)果與討論在粘性質(zhì)粒載體IztapaCos中構(gòu)建了一個(gè)基因組文庫(kù)，該文庫(kù)攜帶有一個(gè)腐草霉素抗性基因，且可直接轉(zhuǎn)入真菌之中，不需進(jìn)一步的亞克隆。首要目標(biāo)——分離出一個(gè)含有整套青霉素基因簇的粘性質(zhì)?？寺　＠谜谆虼貋?lái)增加青霉素基因的拷貝數(shù)而不是轉(zhuǎn)入單個(gè)的pcbAB和pcbC-penDE基因。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，用分別位于基因簇的兩個(gè)末端的探針pcbAB和penDE對(duì)基因組文庫(kù)進(jìn)行了篩選。對(duì)E.coli進(jìn)行的13次克隆證實(shí)這兩個(gè)探針都已分離出來(lái)并獲得了粘性質(zhì)粒DNA。結(jié)果與討論以此方式形成的重組粘性質(zhì)粒繼續(xù)呈遞進(jìn)行Southern分析，分析中仍然使用相同的兩個(gè)探針以確定它們包含整套的青霉素基因簇。其中一個(gè)名為IztapaCos-pen5的粘性質(zhì)粒（圖2第5列），被用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉。結(jié)果與討論轉(zhuǎn)化菌株Wis54-1255和P2-32被轉(zhuǎn)移至腐草霉素濃度不斷增高的瓊脂培養(yǎng)基上，以便選出含有高拷貝數(shù)的選擇標(biāo)記基因ble的菌株，也就是含有高拷貝數(shù)青霉素基因簇的菌株。轉(zhuǎn)化菌株中的6株Wis54-1255和3株P(guān)2-32可以在含有60μg/ml腐草霉素添加劑的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。同時(shí)利用在瓊脂鞘上的發(fā)酵來(lái)檢測(cè)所有轉(zhuǎn)化菌株的青霉素產(chǎn)量。檢測(cè)中青霉素產(chǎn)量最高的菌株是對(duì)60μg/ml腐草霉素有抗性的轉(zhuǎn)化菌株。我們將此兩種菌株中篩選出的青霉素產(chǎn)量最高的轉(zhuǎn)化菌株分別命名為T(mén)W和TP。對(duì)液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵中TW和TP菌株的青霉素產(chǎn)量作了仔細(xì)檢測(cè)，并在同一實(shí)驗(yàn)中與其親本菌株的發(fā)酵產(chǎn)量作了比較。在親本菌株內(nèi)轉(zhuǎn)入IztapaCos（空載體）作為對(duì)照，該轉(zhuǎn)化菌株的青霉素產(chǎn)量略微低于原菌株的青霉素產(chǎn)量。結(jié)果與討論相對(duì)于親本菌株，轉(zhuǎn)化菌株TW和TP的青霉素產(chǎn)量在兩種培養(yǎng)體系中均有顯著提高。然而，來(lái)源于菌株P(guān)2-32的轉(zhuǎn)化菌株TP的青霉素產(chǎn)量則提高的更多。結(jié)果與討論關(guān)于產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum

)青霉素產(chǎn)量的早期研究表明微生物在固態(tài)發(fā)酵中的生理生化反應(yīng)與在液態(tài)發(fā)酵中的大不相同，從而導(dǎo)致了它們?cè)趦煞N培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)量水平的差異。這一信息指出了設(shè)計(jì)能夠特別適合于固態(tài)發(fā)酵菌株的改進(jìn)方法的必要性（Barrios-Gonza′lezetal.1993a;Barrios-Gonza′lezandMej?′a2007）。研究表明越接近于野生型的菌株在固態(tài)發(fā)酵能越高效地發(fā)揮其青霉素生產(chǎn)潛力，這說(shuō)明在遺傳改良過(guò)程中，為適合液態(tài)發(fā)酵而開(kāi)發(fā)的工業(yè)高產(chǎn)菌株，正在失去一些（未知）有助于其在固體培養(yǎng)基上很好地適應(yīng)和生長(zhǎng)的重要功能，（Barrios-Gonza′lezetal.1993a）。尋找這些引起所謂的固體培養(yǎng)生理性的“固體培養(yǎng)基因”已成為當(dāng)前研究的主題（Barrios-Gonza′lezetal.2008;Ishidaetal.2000;TeBiesebekeetal.2005）。結(jié)果與討論這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，菌株Wis54-1255比P2-32更接近于野生型，其由于額外拷貝的轉(zhuǎn)入而導(dǎo)致的在固態(tài)發(fā)酵中產(chǎn)量的增加比P2-32更高。相反地，對(duì)于菌株P(guān)2-32，額外拷貝的轉(zhuǎn)入則在液態(tài)發(fā)酵中起到更加顯著的作用。顯然，在Wis中更加保守的“固態(tài)培養(yǎng)基因”促進(jìn)了其新的生物合成能力在固態(tài)發(fā)酵中的發(fā)揮，而這些基因在菌株P(guān)2中沒(méi)有很好地保留（或激活）。另一項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果也可用相同的原理來(lái)解釋?zhuān)蔷褪荳is在固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵（培養(yǎng)系統(tǒng)）間產(chǎn)量水平的差別在TW轉(zhuǎn)化株上更加顯著，而這種差別在P2轉(zhuǎn)化株上則較小。結(jié)果與討論高青霉素滴度產(chǎn)黃青霉工程菌內(nèi)含有高拷貝的青霉素基因簇，且此高拷貝以串聯(lián)重復(fù)方式排列（Fierroetal.1995;Newbert1997）。到目前為止，通過(guò)轉(zhuǎn)入額外青霉素基因拷貝的方式增加青霉素產(chǎn)量的研究均是在含有單拷貝青霉素基因簇的低產(chǎn)菌株上完成的（Veenstraetal.1991;Theilgaardetal.2001）。我們首次使用了P2-32菌株，據(jù)報(bào)道它含有多達(dá)14個(gè)拷貝的青霉素基因簇（Barredoetal.1989）。Thykaer和Nielsen（2003）提出存在于一株菌株內(nèi)使產(chǎn)量增高的基因簇拷貝數(shù)有一個(gè)上限；他們指出超過(guò)5個(gè)拷貝之后，基因簇拷貝數(shù)與青霉素產(chǎn)量之間不再有線性關(guān)系。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示即使是P2-32這種有著高拷貝青霉素基因簇的菌株，也是對(duì)提高青霉素基因數(shù)量的改進(jìn)策略高度敏感的。結(jié)果與討論如前所述，P2-32轉(zhuǎn)化株在液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵中均比Wis54-1255轉(zhuǎn)化株顯示出更高的青霉素產(chǎn)量的增加（相比于其親本菌株）。對(duì)這些結(jié)果有種與生物合成基因無(wú)關(guān)的解釋。P2是一個(gè)不斷經(jīng)過(guò)突變和篩選而得的高青霉素產(chǎn)量菌株。這意味著它已經(jīng)積累了很多突變，而很多這些突變?cè)诠δ苌吓c生物合成基因不同但可以互補(bǔ)（附屬基因），比如更高的輸出能力。很多這類(lèi)基因已被描述（Kieletal.2005;Lamas-Maceirasetal.2006;Garc?′a-Ricoetal.2008）。這些突變使得更高的青霉素生物合成潛能得到更好地表達(dá)（由于生物合成基因的擴(kuò)增）。因此，已存在于菌株P(guān)2中的互補(bǔ)突變必定使得菌株對(duì)通過(guò)增加青霉素基因簇拷貝數(shù)后獲得的更高的生物合成潛能進(jìn)行更高效的利用。結(jié)果與討論另外，本實(shí)驗(yàn)首次顯示基因劑量的增加對(duì)固態(tài)發(fā)酵中次級(jí)代謝物產(chǎn)量的提高也同樣適用。在這點(diǎn)上，可以預(yù)見(jiàn)本實(shí)驗(yàn)中提出的策略在其最有效的形式下，也可用于其它更適用于固態(tài)發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)，如Ba