中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準鴨病毒性肝炎I型病毒血清中和試驗2004-12-01實施國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局I本標(biāo)準的附錄A為規(guī)范性附錄，附錄B為資料性附錄。本標(biāo)準由國家認證認可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標(biāo)準起草單位：中華人民共和國珠海出人境檢驗檢疫局。本標(biāo)準系首次發(fā)布的出人境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準。本標(biāo)準規(guī)定了鴨病毒性肝炎I型病毒血清中和試驗操作方法。本標(biāo)準適用于檢測血清中的鴨病毒性肝炎I型病毒抗體。主要用于鴨病毒性肝炎的診斷及病原鑒下列縮略語適用于本標(biāo)準。CPE:細胞病變。DEK:鴨胚腎細胞。DEL:鴨胚肝細胞。DHV-I:鴨病毒性肝炎I型病毒。FCS:胎牛血清。MEM:Eagle'sMinimalEssentialMedium細胞培養(yǎng)基.TCID:半數(shù)細胞培養(yǎng)感染量。病毒感染敏感的細胞單層后，可以在細胞單層上生長增殖，并能產(chǎn)生CPE,使感染細胞圓縮、壞死并形成空斑，血清中的特異性抗體能夠抑制病毒在細胞單層上生長，血清抗體中和病毒的能力可以通過其阻止CPE產(chǎn)生的程度加以測定。本中和試驗是應(yīng)用固定病毒量稀釋血清的方法，在DEL或DEK細胞單層上進行中和試驗，用于鴨血清抗體的測定或病原的鑒定。4儀器設(shè)備4.1高壓蒸氣滅菌器。4.4倒置顯微鏡。25.1鴨病毒性肝炎I型病毒。6血清中和空斑減數(shù)試驗6.1病毒毒價測定及配備取DHV-I用維持液將病毒液作10倍系列稀釋，每個稀釋度接種三個培養(yǎng)皿，按7.2.4和7.2.56.2.5每培養(yǎng)皿加人瓊脂維持液3mL,加蓋后，置37℃、3%～5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,取出后用偏光源(或低倍倒置顯微鏡)直接觀察空斑的形成情況，或用10%的福爾馬林固定后用1%的結(jié)晶紫6.3結(jié)果判定6.3.2出現(xiàn)50%空斑減數(shù)的血清最高稀釋倍數(shù)為該血清的抗體滴度。7微量血清中和試驗7.1病毒毒價(TCID?g)測定及配備蓋后，置37℃、3%～5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)96h,取出觀察并記錄CPE,按Reed-Muench方法計算出稀釋度1:4開始每個稀釋度加入等量病毒懸液，稀釋度1:2的加入等量的稀釋液用作血清對照，然后置37℃中和感作60min.7.2.2將感作好的血清混合液加入96孔板內(nèi)(第1～11孔),每孔100μL,每個稀釋度需做4個孔，第12孔加入100μL的稀釋液用作正常細胞對照然后每孔再加入100μL的DEK細胞懸液。7.2.3病毒對照設(shè)立：將病毒稀釋為1000TCIDo/50μL、100TCIDo/50μL、10TCID5o/50μL、7.2.4置37℃、3%～5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)96h,取出后在低倍倒置顯微鏡觀察并記錄CPE,或用10%福爾馬林固定和1%的結(jié)晶紫染色后觀察。7.3.1當(dāng)細胞對照和血清對照正常，陰性血清各孔出現(xiàn)CPE,陽性血清效價與原滴定的效價相差1個7.3.2能夠完全抑制病毒產(chǎn)生CPE的血清最高稀釋倍數(shù)為該血清的抗體中和效價。7.3.3血清抗體效價在1:16以上(含1:16)判為陽性。4(規(guī)范性附錄)A.1水本標(biāo)準所使用的水為三重蒸餾水。A.2Hank's平衡鹽溶液氯化鈉8.0g,葡萄糖1.0g,氯化鉀0.4g,磷酸氫二鈉0.12g,磷酸二氫鉀0.06g,酚紅0.02g,氯化鈣(含2個水)0.18g硫酸鎂(含7個水)0.2g,加水至1000mL,117℃高壓滅菌15min,冷卻后放4℃保存?zhèn)溆?，使用前?.5%的碳酸氫鈉調(diào)整pH值至7.2。氯化鈉8.0g,葡萄糖1.0g,氯化鉀0.4g,磷酸氫二鈉0.12g,磷酸二氫鉀0.06g,酚紅0.02g,加水至1000mL,117℃高壓滅菌15min,冷卻后放4℃保存?zhèn)溆?，使用前?.5%的碳酸氫鈉調(diào)整pH值至7.2。A.6細胞培養(yǎng)液為購買的成品MEM培養(yǎng)基，按說明配制，放4℃保存?zhèn)溆?，使用時按10%的FCS、2mmol/L谷(氨)酰胺、0.17%的碳酸氫鈉和1%的抗菌素溶液加入配成細胞培養(yǎng)液。A.7維持液為購買的成品MEM培養(yǎng)基，按說明配制，放4℃保存?zhèn)溆?，使用時加入1%的抗菌素溶液。A.8瓊脂維持液為購買的成品MEM培養(yǎng)基，按說明兩倍量配制成2×的MEM培養(yǎng)液，使用時按4%加入雞血清和按0.2%加入FCS,然后再與等量的2%瓊脂溶液混合，并使混合液溫度保持在45℃左右備用。A.9稀釋液為購買的成品BME(Eagle'sBasalMedium)培養(yǎng)基，按說明配制，放4℃保存?zhèn)溆?，使用時加入1%的抗菌素溶液。A.10細胞生長液為購買的成品BME(Eagle'sBasalMedium)培養(yǎng)基，按說明配制，放4℃保存?zhèn)溆?，使用時按10%的胰蛋白胨磷酸鹽培養(yǎng)液(Trytosephosphatebroth)、2mmol/L谷(氨)酰胺、0.17%的碳酸氫鈉、1%的抗菌素溶液和4%的雞血清加入配成細胞生長液。5(資料性附錄)原代細胞制備B.1DEL細胞單層準備選用來自健康種鴨群的14d～17d的鴨胚，用碘酒和酒精消毒蛋殼表面，打開氣室，以滅菌鑷子取出鴨胚，放在滅菌平皿內(nèi)，剖腹取出肝臟(去除膽囊),放于燒杯內(nèi)用Hank's平衡鹽溶液沖洗三次，用滅菌剪刀剪碎，再用Hank’s平衡鹽溶液沖洗三次(加入溶液后讓組織塊自然下沉，再將溶液倒出),盡可能去除血液；然后加入5倍～10倍于組織碎塊的量的胰酶消化液，置37℃水浴消化20min,吸去胰酶消碎塊為止)。移入刻度離心管，以500r/min離心1min,取細胞泥，按每毫升含1.5×10°個細胞的比例用細胞培養(yǎng)液稀釋，然后加入培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿5mL,加蓋后置含5%二氧化碳的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h～72h長成細胞單層備用。選用來自健康種鴨群的22d～25d的鴨胚，用碘酒和酒精消毒蛋殼表面，打開氣室，以滅菌鑷子取出鴨胚，放在滅菌平皿內(nèi)，剖腹取出腎臟，放丁燒杯內(nèi)用Hank’s平衡鹽溶液沖洗三次，用滅菌剪刀剪碎，再用Hank’s平衡鹽溶液沖洗三次(加入溶液后讓組織塊自然下沉，再將溶液倒出),盡可能去除血液；然后加入5倍～