巖藻聚糖在化學(xué)污染及慢性腎功能不全伴不育小鼠模型附睪表達研究近年來,男性因素所致不孕不育癥發(fā)病率呈增高趨勢。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn),腎臟疾病及環(huán)境污染因素致使精子發(fā)育異常引起的不孕不育病例明顯增加,精子成熟的分子生物學(xué)研究具有極強的臨床應(yīng)用前景。正常生理條件下,精子在睪丸生精小管內(nèi)生成并高度分化,但尚未完全成熟,在通過附睪管運行過程中,經(jīng)與附睪管腔液微環(huán)境中的相關(guān)因子作用,獲得運動能力后方具備使卵子受精的潛能。附睪分為起始部、頭部、體部、尾部四部分,頭部由睪丸輸出小管組成,體、尾部由附睪管組成,尾部與輸精管相連。精子成熟開始于附睪頭部,附睪上皮分泌的蛋白通過參與精子質(zhì)膜在頂體反應(yīng)、精卵識別和融合中的作用來調(diào)控精子的成熟和獲能。文獻報道人精漿(雄性生殖道分泌的蛋白、糖蛋白、肽等多種分泌物的混合物)中游離巖藻聚糖含量達到0.3-0.4mg/ml,并富含Le~X和Le~Y的抗原決定基和大量糖基轉(zhuǎn)移酶,推測巖藻聚糖序列可能具有增強精子前向運動能力、促進雌性輸卵管中精卵的結(jié)合和免疫抑制等作用。Lewis聚糖是巖藻糖化的乳糖系列聚糖,根據(jù)其糖鏈結(jié)構(gòu)不同分為Le~X、Le~Y、Le~a、Le~b、sLe~X等,而Le~X、Le~Y的差異只是末端巖藻糖Fucα1-2的有無。Lewis聚糖與個體發(fā)育、器官形成、造血細(xì)胞分化及腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們對Lewis聚糖在雌性生殖系統(tǒng)中的功能研究顯示:巖藻聚糖抗原Le~Y在著床期子宮內(nèi)膜細(xì)胞和胚泡中持續(xù)高表達,在卵巢激素調(diào)節(jié)下作為信息分子參與母-胎識別、黏附和調(diào)控著床。催化Lewis聚糖合成的關(guān)鍵酶(巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUTs)在圍著床期子宮內(nèi)膜表達趨勢與Lewis聚糖蛋白表達一致,說明寡糖合成受其合成關(guān)鍵酶基因調(diào)控。腎臟病由于腎臟排泄、內(nèi)分泌、免疫及代謝等功能發(fā)生的一系列病理生理改變,使機體內(nèi)環(huán)境紊亂,最終導(dǎo)致其它器官發(fā)生病變。建立一個類似人體的動物腎臟病模型,有利于對腎臟疾病及其誘發(fā)疾病的研究。鎘作為橡膠制品、電池、香煙、肥料中的重要成分,是已知最易在體內(nèi)蓄積的環(huán)境毒物;研究表明,少量的鎘進入人體即可通過生物放大作用和生物積累,對動物器官特別是對生殖系統(tǒng)器官產(chǎn)生毒性作用。本實驗首先探討建立兩個動物模型:一個是應(yīng)用氯化鎘模擬化學(xué)污染造成的損害模型,另一個是應(yīng)用腺嘌呤模擬慢性腎功能不全的模型,從而比較附睪中的Le~X、Le~Y糖蛋白正常狀態(tài)和這兩種模擬病態(tài)狀態(tài)下的分泌、表達有什么不同。(一)化學(xué)污染小鼠模型及慢性腎功能不全伴隨不育小鼠模型制備通過小鼠死亡情況、體重變化情況、大體形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)方法檢測各項指標(biāo),對檢測結(jié)果綜合分析:選用C57雄性小鼠用氯化鎘制作化學(xué)污染小鼠模型通過檢測得出的結(jié)果是應(yīng)用1.5mg/kg劑量組制作模型符合實驗設(shè)計要求。選用昆明雄性小鼠,用含0.4%腺嘌呤藥物飼養(yǎng)組、模型小劑量組(腺嘌呤300mg/kg)和模型大劑量組(腺嘌呤500mg/kg),確定應(yīng)用0.4%藥物飼養(yǎng)制作的動物模型符合實驗設(shè)計要求。(二)RT-PCR技術(shù)檢測氯化鎘組:Le~X、Le~Y合成的關(guān)鍵酶基因FUT9和FUT1、FUT4在附睪頭、體、尾中的表達實驗組明顯低于對照組,說明氯化鎘抑制了Le~X、Le~Y的合成。腺嘌呤組:FUT9和FUT1、FUT4在附睪頭、體、尾的表達實驗組高于正常組。腺嘌呤刺激上調(diào)了Le~X、Le~Y合成。(三)免疫組化技術(shù)檢測結(jié)果氯化鎘化學(xué)污染模型組:在睪丸中,實驗組和對照組均未見Le~X、Le~Y表達。在附睪頭部,實驗組Le~X的表達主要在管腔少量分泌物中,對照組Le~X陽性表達主要分布在管壁細(xì)胞;在附睪體、尾Le~X的表達實驗組低于對照組。Le~Y的分布與表達強度和Le~X相似。結(jié)果分析顯示,氯化鎘能使實驗組附睪的管壁細(xì)胞和管腔分泌物中Le~X和Le~Y的表達都明顯降低。腺嘌呤模擬慢性腎功能不全的模型組:Le~X在睪丸中未見陽性表達;在附睪頭部表達主要分布在管壁和管腔分泌物中,而對照組主要分布在管壁。實驗組Le~X在附睪體、尾表達高于對照組。Le~Y在睪丸中各組均未見陽性表達;在附睪的頭、體、尾實驗組與對照組的Le~Y分布無差異,表達強度略高于對照組。(四)Western–blot技術(shù)檢測結(jié)果氯化鎘組:實驗組的Le~X和Le~Y蛋白在附睪頭、體、尾及睪丸中表達量與對照組相比明顯降低。腺嘌呤組:附睪頭、體、尾及睪丸中均有Le~X和Le~Y蛋白表達。實驗組