2.2動物細(xì)胞工程動物細(xì)胞培養(yǎng)1、動物細(xì)胞工程常用技術(shù)有哪些？基礎(chǔ)技術(shù)是？2、動物細(xì)胞培養(yǎng)的定義、原理、培養(yǎng)對象、目的？3、動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件？如何維持無菌、無毒環(huán)境？適宜的溫度和pH分別是多少？滲透壓的影響因素？適宜的氣體環(huán)境包括？分別有什么作用？如何維持？4、動物細(xì)胞培養(yǎng)流程？體外培養(yǎng)動物細(xì)胞的種類？5、細(xì)胞貼壁、接觸抑制、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)的定義6、動植物細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)別（原理、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基特有成分、培養(yǎng)結(jié)果、細(xì)胞來源、特點(diǎn)）和相同之處7、干細(xì)胞的定義、種類、應(yīng)用動物細(xì)胞培養(yǎng)是指從動物體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細(xì)胞，然后在適宜的培養(yǎng)條件下，讓這些細(xì)胞生長和增殖的技術(shù)。定義：細(xì)胞增殖原理：胚胎或幼齡動物細(xì)胞培養(yǎng)對象：獲得細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物目的：一、動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件營養(yǎng)條件其他條件動物細(xì)胞培養(yǎng)所需的基本條件＜＞糖類、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素……無菌、無毒的環(huán)境適宜溫度、pH、滲透壓適宜的氣體環(huán)境1、營養(yǎng)合成培養(yǎng)基：將細(xì)胞所需營養(yǎng)物質(zhì)按種類和所需量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基，加入血清等一些天然成分。培養(yǎng)動物細(xì)胞一般使用液體培養(yǎng)基，也稱為培養(yǎng)液。▲培養(yǎng)皿▲培養(yǎng)瓶2、無菌、無毒的環(huán)境需要對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進(jìn)行滅菌處理以及在無菌環(huán)境下進(jìn)行操作。培養(yǎng)液還需要定期更換，以便清除代謝物，防止細(xì)胞代謝物積累對細(xì)胞自身造成危害?！瑑艄ぷ髋_▲酒精燈火焰附近3、溫度、pH和滲透壓溫度：(36.5±0.5)℃pH：7.2~7.44、氣體環(huán)境O2是細(xì)胞代謝所必需的CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH。通常采用培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶，并將它們置于含有95%空氣和5%CO2的混合氣體的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。二.動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程取動物組織制成細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液原代培養(yǎng)轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱機(jī)械法酶解法：胰蛋白酶和膠原蛋白酶動物組織經(jīng)過處理后的初次培養(yǎng)轉(zhuǎn)入分瓶傳代培養(yǎng)動物組織經(jīng)過分瓶后的培養(yǎng)CO2培養(yǎng)箱貼壁細(xì)胞的收集：懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的收集：離心法胰蛋白酶等處理后離心可以用胃蛋白酶在體外分散細(xì)胞嗎？

不可以；胃蛋白酶作用的適宜pH約為2，當(dāng)pH大于6時，胃蛋白酶就會失去活性，多數(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜pH為7.2~7.4，胃蛋白酶在此環(huán)境中沒有活性?！N壁生長示意圖▲接觸抑制示意圖培養(yǎng)瓶壁1、能夠懸浮在培養(yǎng)液中生長增殖的細(xì)胞2、細(xì)胞貼壁的細(xì)胞當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時，細(xì)胞通常會停止分裂增殖（接觸抑制）懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞會因細(xì)胞密度過大、有害代謝物積累和培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等因素而分裂受阻。體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞可以分為哪兩類？比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)結(jié)果細(xì)胞來源特點(diǎn)相同點(diǎn)植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖液體培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基，天然培養(yǎng)基植物激素、有機(jī)添加物（蔗糖）血清、葡萄糖等新個體或大量細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)品細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)品離體的植物器官、組織或細(xì)胞胚胎或幼齡動物組織1、分裂形成愈傷組織2、分化形成胚狀體1、只分裂不分化2、貼壁生長，接觸抑制無菌操作、適宜的環(huán)境、只進(jìn)行有絲分裂三.干細(xì)胞培養(yǎng)及應(yīng)用動物和人體內(nèi)仍保留的少數(shù)具有分裂和分化能力的細(xì)胞1.概念2.分布早期胚胎骨髓臍帶血3.分類：發(fā)育階段分：胚胎干細(xì)胞（ES干細(xì)胞）和成體干細(xì)胞成體干細(xì)胞：位于成體組織或器官內(nèi)的干細(xì)胞。如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、精原干細(xì)胞等。紅細(xì)胞血小板各類白細(xì)胞造血干細(xì)胞

成體干細(xì)胞具有組織特異性，只能在特定的組織中分化成特定的細(xì)胞或組織，不具有發(fā)育成完整個體的能力。分化潛能分：全能干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞多能干細(xì)胞：臍帶干細(xì)胞、胎盤干細(xì)胞專能干細(xì)胞：神經(jīng)干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）——類似于胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞iPS細(xì)胞多種體細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化體外誘導(dǎo)人的成纖維細(xì)胞白血病、帕金森病、阿而茨海默病等治療誘導(dǎo)過程無須破壞胚胎，而且iPS細(xì)胞可以來源于病人自身的體細(xì)胞，將它移植回病人體內(nèi)后，理論上可以避免免疫排斥反應(yīng)，定向誘導(dǎo)分化4.應(yīng)用：通過造血干細(xì)胞的移植可以治療白血病、遺傳性血液?。ㄈ绲刂泻Ｘ氀⒀涸偕系K性貧血、鐮刀狀細(xì)胞貧血）等疾病。白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病?？寺⌒园籽〖?xì)胞因?yàn)樵鲋呈Э?、分化障礙、凋亡受阻等機(jī)制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他非造血組織和器官，同時抑制正常造血功能。臨床可見不同程度的貧血、出血、感染發(fā)熱以及肝、脾、淋巴結(jié)腫大和骨骼疼痛。自體移植科學(xué)家正在研究用胚胎干細(xì)胞治療神經(jīng)退行性疾?。ㄈ缗两鹕　柎暮Ｄ〉龋?、糖尿病、心肌壞死等疾病。動物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體抗體本質(zhì)：分布：具有免疫功能的球蛋白血清（主要），組織液及外分泌液滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞其抗原結(jié)構(gòu)。滅活、化學(xué)提純多種抗原注射多種抗原多克隆抗體從血清中分離產(chǎn)量低特異性差病毒如何抗體解決產(chǎn)量低和特異性差的問題？惡性增殖的骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞一.動物細(xì)胞融合技術(shù)

動物細(xì)胞融合技術(shù)就是使兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的技術(shù)。1.概念：2.原理：細(xì)胞膜的流動性3.方法：PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法等4.結(jié)果：形成具有原來兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞（雜交細(xì)胞）突破有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段；為制造單克隆抗體開辟新途徑5.意義：二.單克隆抗體1.定義：單克隆抗體是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體二.單克隆抗體注射特定的抗原培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合2.過程：特定抗原免疫小鼠，從脾中獲取產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞多種雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體)用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，除融合的雜交瘤細(xì)胞生長以外，其他細(xì)胞都會死亡96孔板，用于培養(yǎng)和篩選雜交瘤細(xì)胞將細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋后進(jìn)行接種。每一個孔盡量只接種一個雜交瘤細(xì)胞多種雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體)抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞(分泌的抗體能與特定抗原結(jié)合)對上述經(jīng)選擇培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選，就可獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細(xì)胞。多種雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體)抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞將抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)，或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖。從細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠腹水中獲取大量的單克隆抗體小鼠腹腔注射體外培養(yǎng)單克隆抗體思考第一次：用特定的選擇培養(yǎng)基篩選得到雜交瘤細(xì)胞第二次：用96多孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)得到能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞1、兩次篩選的方法和目的分別是什么呢？2、單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)？特異性強(qiáng)、靈敏度高、可大量制備3.應(yīng)用：

1、生物導(dǎo)彈——靶向運(yùn)輸藥物治療疾病單克隆抗體能準(zhǔn)確地識別抗原的細(xì)微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，利用同位素或熒光標(biāo)記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術(shù)，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病，純度高、特異性強(qiáng)，具有準(zhǔn)確、高效、簡易、快速的優(yōu)點(diǎn)。

2、作為診斷試劑用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”，再妊娠地8天就可以做出診斷，這筆原來的診斷提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準(zhǔn)確率在90%以上。動物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交原理相關(guān)酶誘導(dǎo)手段誘導(dǎo)過程結(jié)果用途意義細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞膜的流動性、植物細(xì)胞的全能性胰蛋白酶，膠原蛋白酶纖維素酶，果膠酶雜交細(xì)胞雜種植物培育新品種克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙使遠(yuǎn)緣雜交成為可能制備單克隆抗體等動物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動物“（悟空）拔一把毫毛，丟在口中嚼碎，望空噴去，叫一聲‘變!’即變作三二百個小猴，周圍攢簇?！边@是《西游記》中的一段描述。動物細(xì)胞核移植技術(shù)▲我國自主培育的體細(xì)胞克隆牛定義：將動物一個細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞中，使這個重新組合的細(xì)胞發(fā)育成新胚胎，進(jìn)而發(fā)育成動物個體的技術(shù)。原理：動物細(xì)胞核的全能性生殖方式：無性生殖分類：胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植使用設(shè)備從牛卵巢中采集卵母細(xì)胞，在體外培養(yǎng)到MⅡ期通過顯微操作去核體細(xì)胞核移植的過程為什么要選處于MⅡ期的卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞？使用設(shè)備從牛卵巢中采集卵母細(xì)胞，在體外培養(yǎng)到MⅡ期通過顯微操作去核高產(chǎn)奶牛（供體）取體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)將供體細(xì)胞注入去核的卵母細(xì)胞通過電融合法使兩細(xì)胞融合，供體核進(jìn)入卵母細(xì)胞，形成重構(gòu)胚。將胚胎移入受體（代孕）母牛體內(nèi)生出與供體奶牛遺傳物質(zhì)基本相同的牛犢重構(gòu)胚是指人工重新構(gòu)建的胚胎，具有發(fā)育成完整個體的能力。用物理或化學(xué)方法（如電刺激、Ca2+載體、乙醇和蛋白酶合成抑制劑等）激活重構(gòu)胚，使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育進(jìn)程。1．為什么要選用處于MⅡ期的卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞？2．將供體細(xì)胞整個注入去核卵細(xì)胞的原因？3．供體細(xì)胞一般用傳代幾代以內(nèi)的細(xì)胞？為什么？4、該進(jìn)程還用了哪些技術(shù)？治療性克隆體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景及存在的問題畜牧生產(chǎn)醫(yī)藥衛(wèi)生治療疾病保護(hù)物種以患者作為供體培育人核移植胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因克隆動物可以作為異種移植的供體保護(hù)瀕危物種，增加存活數(shù)量克隆動物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白加速家畜遺傳改良進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)良畜群繁育1、干細(xì)胞技術(shù)、異種（如豬）器官抑制為解決器官移植問題提供了新方法。下列相關(guān)敘述正確的是（多選）（）A、器官移植面臨著移植供體的來源不足的困難B、用患者自身干細(xì)胞治療可避免異體移植產(chǎn)生免疫排斥C、以豬器官作異種器官來源時無需考慮其體內(nèi)存在的病毒D、以病毒DNA為載體將體細(xì)胞誘導(dǎo)成干細(xì)胞有潛在的風(fēng)險ABD2、關(guān)于單克隆抗體，下列敘述不正確的是（）A、組成單克隆抗體的基本單位是氨基酸B、單克隆抗體僅特異性地對同一抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)C、單克隆抗體的