第3章

基因工程工程第2節(jié)

基因工程的基本操作程序（第1課時）目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建121簡述PCR的原理、條件及過程(重點)。2簡述基因表達(dá)載體的組成及構(gòu)建過程(重、難點)。31.目的基因的篩選與獲取4.目的基因的檢測與鑒定2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞基因工程的基本操作程序目的基因概念在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。實例與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因第一步目的基因的篩選與獲取41.(2023·山西太原高二診斷)下列有關(guān)獲取目的基因的敘述，錯誤的是

A.目的基因就是編碼蛋白質(zhì)的基因B.獲取目的基因是基因工程的第一步C.來自蘇云金桿菌的Bt抗蟲蛋白基因可作為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因D.序列比對工具的應(yīng)用為科學(xué)家找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會√目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子，A錯誤。5培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細(xì)胞抗蟲棉提取表達(dá)Bt基因?qū)肱c載體拼接重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測與鑒定Bt基因蘇云金桿菌6當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡?！鞠嚓P(guān)信息】P77①Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理？②抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會不會對人畜產(chǎn)生危害？Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響7（一）篩選合適目的基因：1.較為有效的方法之一從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選。2.認(rèn)識基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法測序技術(shù)序列數(shù)據(jù)庫序列比對工具8獲取目的基因的方法91.人工合成目的基因。2.通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因。3.常用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因?？瓜x基因快速獲得大量抗蟲基因蘇云金桿菌提取PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。（三）利用PCR獲取和擴(kuò)增

目的基因：1.發(fā)明者10DNA半保留復(fù)制原理

體外操作環(huán)境對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制目的短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因優(yōu)點聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)全稱PCR在一定的緩沖溶液中進(jìn)行，一般要添加Mg2＋。DNA聚合酶需要Mg2＋激活11【重溫】DNA復(fù)制的過程1.解旋2.合成子鏈3.形成新DNA12ATP3′5′為什么子鏈的延伸方向是5′→3′？DNA聚合酶3′5′模板鏈子鏈因為DNA聚合酶不能直接將單個的核苷酸聚合成鏈，只能將單個核苷酸加到已有鏈的3′-端DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有鏈的3′-端為什么子鏈合成需要引物？13引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸。3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2什么是引物？3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈2引物可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈，細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制通常以RNA單鏈為引物細(xì)胞外（PCR）一般以DNA單鏈為引物用于PCR的引物長度通常為20~30個核苷酸。引物結(jié)合在模板鏈的3’端14PCR擴(kuò)增儀DNA分子電泳15儀器一定量的模板DNA引物4中脫氧核苷酸dNTP緩沖液熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）Mg2+作為DNA復(fù)制的模板使DNA聚合酶能從引物3′端開始連接脫氧核苷酸作為合成DNA子鏈的原料提供相對穩(wěn)定的pH環(huán)境催化合成DNA子鏈真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活DNA復(fù)制所需的基本條件16ATP與dATP在結(jié)構(gòu)上有什么區(qū)別？dATP為什么能用作DNA復(fù)制的底物？如圖所示，ATP結(jié)構(gòu)中的五碳糖為核糖，而dATP結(jié)構(gòu)中的五碳糖為脫氧核糖。ATP轉(zhuǎn)移掉兩個磷酸基團(tuán)后剩下的結(jié)構(gòu)就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是轉(zhuǎn)錄的底物；同理，dATP轉(zhuǎn)移掉兩個磷酸基團(tuán)后剩下的結(jié)構(gòu)就是腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA復(fù)制的底物。171）變性（不需要解旋酶）：當(dāng)溫度上升到_______以上時，

斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條

。

氫鍵單鏈DNA待擴(kuò)增的DNA片段第一步：變性3’3’5’5’3’5’3’5’變性90℃思考：變性的溫度為何是90℃以上的一個溫度范圍？因為變性的溫度與氫鍵的數(shù)量有關(guān)。當(dāng)氫鍵數(shù)量越多時，所需溫度就越高；反之，當(dāng)氫鍵數(shù)量越少時，所需溫度也就越低。PCR反應(yīng)的過程182）復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過

與兩條單鏈DNA結(jié)合。

第二步：復(fù)性引物1引物2DNA引物3’5’3’5’堿基互補(bǔ)配對5’5’思考：為什么需要引物？引物結(jié)合在模板鏈的什么位置？①因為Taq酶(DNA聚合酶)不能從頭合成DNA。②引物結(jié)合在DNA模板鏈

3'端位置，Taq酶只能從引物的3′端開始延伸DNA鏈。3’3’193）延伸：當(dāng)溫度上升到______左右時，溶液中的4種____________在耐高溫的____________的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。

第三步：延伸引物1引物2Taq酶Taq酶3’5’3’5’脫氧核苷酸5’5’DNA聚合酶72℃3’3’3’3’72℃是Taq酶的最適溫度Taq酶結(jié)合在引物的3’端目的基因的篩選與獲取20第一輪循環(huán)的產(chǎn)物第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪的產(chǎn)物

由于一個循環(huán)得到的產(chǎn)物又可以作為下一個循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。

即成指數(shù)形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。PCR反應(yīng)的結(jié)果215’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’【問題探究】PCR技術(shù)獲取目的基因時至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？22三次循環(huán)（1）要保證目的基因能與載體相連接，還要對引物進(jìn)行什么操作？要在兩種引物的5′端分別添加上限制酶的識別序列。233’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2（2）設(shè)計引物的依據(jù)是？已知目的基因兩端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根據(jù)該序列合成引物。

第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪的產(chǎn)物3’5’3’5’3’5’3’5’第一輪循環(huán)的產(chǎn)物3’5’3’5’01目的基因的篩選與獲取242個引物6個引物14個引物（3）如果循環(huán)n次，則共需消耗

個引物。

則共需消耗

對引物。復(fù)制次數(shù)123nDNA分子數(shù)2482n含引物的DNA分子數(shù)2482n含其中一種引物的DNA分子數(shù)1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同時含兩種引物的DNA分子數(shù)0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的對數(shù)1＝21－13＝22－17＝23－12n－1含脫氧核苷酸鏈等長的DNA分子數(shù)0＝21－20＝22－42＝23－62n－2nPCR中的數(shù)量關(guān)系25（1）PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)

（

）（2）PCR擴(kuò)增技術(shù)中，需用解旋酶使雙鏈DNA解聚

（

）（3）PCR過程使用的DNA聚合酶的特點是耐高溫

（

）（4）PCR技術(shù)中，DNA模板鏈上堿基G和C的比例越高，DNA變性解鏈的溫度就越高

（

）判斷?？颊Z句，澄清易混易錯目的基因的篩選與獲取262.下列有關(guān)PCR技術(shù)的說法，錯誤的是A.PCR是一項在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)B.PCR技術(shù)的原理是DNA半保留復(fù)制C.PCR的特異性主要取決于引物的堿基序列特異性D.PCR擴(kuò)增中需要解旋酶解開雙鏈DNA√解析引物的堿基序列特異性決定了PCR的特異性，C正確；PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA受熱變性后解聚為單鏈，不需要解旋酶解開雙鏈DNA，D錯誤。27用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？ P79mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。28產(chǎn)物進(jìn)行鑒定瓊脂糖凝膠電泳

DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就叫電泳。29PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點原則原料條件不同點解旋方式場所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞內(nèi)（主要在細(xì)胞核內(nèi)）耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子30311.PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，該技術(shù)的原理是DNA半保留復(fù)制。2.PCR反應(yīng)進(jìn)行的條件有緩沖溶液、DNA模板、2種引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、溫度條件等。3.PCR擴(kuò)增的過程：變性→復(fù)性→延伸。問題:獲取了足夠量的目的基因后，能直接把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞嗎？就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞不再含有目的基因游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會直接被分解

不能原因那怎樣才能讓基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代呢？321.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的：2.基因表達(dá)載體的組成（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。e復(fù)制原點33基因表達(dá)載體的構(gòu)建人們所需要的基因作用：便于重組DNA分子的篩選位置：功能：基因的下游（一段特殊的DNA片斷）終止轉(zhuǎn)錄位置：功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA?；虻纳嫌危ㄒ欢斡刑厥饨Y(jié)構(gòu)的DNA片段）DNA復(fù)制的起始位點啟動子下游和終止子上游。因為只有插入在啟動子和終止子之間，目的基因才可以正常表達(dá)。34構(gòu)建基因表達(dá)載體時，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？不能因為SmaⅠ切割會破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。請結(jié)合下圖，回答問題：質(zhì)粒上的抗性基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無法進(jìn)一步篩選。35啟動子終止子起始密碼子終止密碼子【區(qū)分兩組概念】位于基因上位于mRNA上翻譯的起始點翻譯的終點轉(zhuǎn)錄的起始點轉(zhuǎn)錄的終點(本身不轉(zhuǎn)錄)決定氨基酸AUG(甲硫氨酸）GUG（纈氨酸）不