關(guān)于花藥和花粉培養(yǎng)第一節(jié)花粉和花藥培養(yǎng)的概念和應(yīng)用一、花粉和花藥培養(yǎng)的概念二、花藥和花粉培養(yǎng)的歷史三、花粉和花藥培養(yǎng)的應(yīng)用第2頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天花粉和花藥的培養(yǎng)(pollenandantherculture)

是指在人工合成培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑,使其不形成配子，而像體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂、分化，由單個(gè)花粉粒發(fā)育成完整單倍體植株的技術(shù)。一、概念第3頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天第4頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天異同點(diǎn)：相同點(diǎn)：二者培養(yǎng)的目的一樣，都是要誘導(dǎo)花粉細(xì)胞發(fā)育成單倍體細(xì)胞，最后發(fā)育成單倍體植株。不同點(diǎn)：

①花藥培養(yǎng)屬器官培養(yǎng)，花藥是植物花的雄性器官，包括體細(xì)胞性質(zhì)的藥壁和藥隔組織，以及雄性性細(xì)胞的花粉粒；花粉培養(yǎng)屬細(xì)胞培養(yǎng)。

②花粉培養(yǎng)沒(méi)有藥壁組織干擾，可計(jì)數(shù)小孢子產(chǎn)胚率，可觀察雄核發(fā)育的全過(guò)程。

③單倍體產(chǎn)量高。

④花粉培養(yǎng)技術(shù)更復(fù)雜，比花藥培養(yǎng)難度大。第5頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、植物花藥/花粉培養(yǎng)歷史Guha和Maheshwari（1964）曼陀羅花藥培養(yǎng)Nitsch和Norreel(1973)煙草花粉培養(yǎng)（游離小孢子培養(yǎng)）Chu（1973）小麥花粉培養(yǎng)（早期花藥培養(yǎng)主要依靠小孢子的自然胚胎發(fā)生產(chǎn)生單倍體，能自發(fā)形成胚胎發(fā)生的基因頻率較低，效率極低）80年代后期到90年代期間，花培技術(shù)迅速發(fā)展。許多作物小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成功。十字花科、麥類(lèi)、水稻、玉米等。90年代，一些先前被認(rèn)為是不易進(jìn)行小孢子培養(yǎng)的基因型也相續(xù)成功Konzak(1999)。第6頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天通過(guò)花藥培養(yǎng)育成的甜椒新品種

：

海花三號(hào)

第7頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用1)誘導(dǎo)形成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期；供體植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核發(fā)育自然加倍人工加倍純合植株DH（2n）一年內(nèi)獲得純系常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年。1、作物育種第8頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天常規(guī)育種在雜交F5、F6代開(kāi)始選擇；花藥培養(yǎng)在F1或F2代進(jìn)行培養(yǎng)，再人工加倍處理．縮短育種周期3--5年克服后代分離，大大縮短育種周期第9頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天花粉單倍體是純合配子體，從來(lái)源于配子體的植株中選擇某一種基因型的概率是(1/2)n，而從常規(guī)雜交F2代群體中，選擇某一基因型的概率為(1/2)2n，故單倍體育種的選擇效率為常規(guī)育種的2n倍。2)提高目標(biāo)基因型的選擇效率第10頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因?yàn)锳Abb的純合單株

常規(guī)方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb、aAbb區(qū)分開(kāi)。

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb Aabbab aAbB aabBaAbb aabb第11頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天例子：

二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因?yàn)锳Abb的純合單株

單倍體方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/4。

單倍體

二倍體

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供體親本AaBb花培

從來(lái)源于配子體的植株中選擇某一種基因型的概率是(1/2)n，而從常規(guī)雜交F2代群體中，選擇某一基因型的概率為(1/2)2n，故單倍體育種的選擇效率為常規(guī)育種的2n倍。第12頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天

3)誘變育種中的作用植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當(dāng)代及時(shí)獲得突變個(gè)體，染色體加倍后成為穩(wěn)定的純系。第13頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天可探索親本染色體組的構(gòu)成。分析單倍體植物減數(shù)分裂時(shí)，形成二價(jià)體的數(shù)目和形狀，能確定染色體組內(nèi)是否存在同源染色體。2、物種進(jìn)化研究

第14頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天

單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個(gè)基因的作用均能表現(xiàn)出來(lái)。能用來(lái)研究基因的性質(zhì)及其作用。還可用于基因的劑量效應(yīng)分析。3、遺傳分析

第15頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、構(gòu)建連鎖圖譜

雙單倍體（DH）群體是永久性群體，能有效地用于遺傳圖譜的構(gòu)建。能直接表達(dá)外源基因，不受顯隱性影響。5、植物基因克隆篩選

第16頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)花粉孢子體發(fā)育途徑概念：花粉孢子體發(fā)育途徑（雄核發(fā)育途徑）

花粉是產(chǎn)生花粉植株的原始細(xì)胞，其第一次有絲分裂，在本質(zhì)上與合子的第一次孢子體分裂相似，把花粉形成植株的途徑稱(chēng)為花粉孢子體發(fā)育途徑，也叫雄核發(fā)育途徑。第17頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、花粉發(fā)育的階段花粉離體培養(yǎng)時(shí)，雄核發(fā)育最適宜的時(shí)期一般是第一次有絲分裂或之前。第18頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、雄核發(fā)育途徑1、A途徑小孢子第一次有絲分裂為非均等分裂，形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞

（1）A-V途徑由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體（2）A-G途徑由生殖細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體（3）A-VG途徑（E途徑）由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞各自獨(dú)立分裂，共同形成單倍體（4）C途徑營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過(guò)核融合，形成多倍體植株2、B途徑

小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個(gè)細(xì)胞。然后由這兩細(xì)胞邊續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株第19頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天第20頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1、胚狀體發(fā)育途徑

小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個(gè)階段，最后子葉展開(kāi)，形成花粉植株。2、愈傷組織發(fā)育途徑

小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會(huì)出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜。三、花粉植株形態(tài)發(fā)生方式第21頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天胚狀體發(fā)育途徑部分花藥通過(guò)胚狀體途徑形成小植株煙草花藥培養(yǎng)第22頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天愈傷組織發(fā)育途徑部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)第23頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株水稻花藥培養(yǎng)第24頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)方法一、花藥培養(yǎng)二、花粉培養(yǎng)三、白化苗現(xiàn)象四、影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素第25頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、花藥培養(yǎng)1、取材

鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時(shí)期，選取大小適宜的花蕾。

2、消毒

70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，無(wú)菌水沖洗3-5次。

3、培養(yǎng)

固體或液體培養(yǎng)基均可。先進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。第26頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、花粉培養(yǎng)(一)花粉的分離與純化

1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法)

將花藥接種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動(dòng)散落后，收集培養(yǎng)。2、擠壓法

在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。第27頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天1）磁攪拌法

用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來(lái)；2）超速旋切法

通過(guò)攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來(lái)（此法應(yīng)用最廣）。4、小孢子純化對(duì)上述方法獲得的小孢子混合物進(jìn)行分級(jí)過(guò)篩、梯度離心處理純化小孢子3、機(jī)械游離第28頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天梯度離心前（小孢子形態(tài)、活力不一致）30%蔗糖梯度離心后（獲得均一的小孢子群體）第29頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天(二)花粉培養(yǎng)方式1、平板培養(yǎng)花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng)花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng)花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。

4、看護(hù)培養(yǎng)

利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。用一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織來(lái)看護(hù)單個(gè)細(xì)胞，并使其生長(zhǎng)和增殖。這個(gè)愈傷組織塊稱(chēng)為看護(hù)愈傷組織。第30頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天1）在一個(gè)培養(yǎng)瓶中加入一定量厚的固體培養(yǎng)基，滅菌后備用。2）在無(wú)菌條件下，將一小塊（1cm3）活躍生長(zhǎng)的愈傷組織接種到培養(yǎng)基上，再在愈傷組織塊上放一片（1cm2）已滅菌的濾紙，放置過(guò)夜。3）將分離的花粉接種到已經(jīng)充分吸收愈傷組織滲透液的濾紙上。4）單細(xì)胞分裂形成肉眼可見(jiàn)的小細(xì)胞團(tuán)后，即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)，得到單細(xì)胞無(wú)性系。具體方法2.第31頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、微室培養(yǎng)

利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)。6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)

利用培養(yǎng)過(guò)花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；ㄋ帡l件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。第32頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天花粉培養(yǎng)過(guò)程取花蕾（鏡檢）預(yù)培養(yǎng)數(shù)天取花藥消毒分離花粉接種培養(yǎng)愈傷組織發(fā)生第33頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、白化苗現(xiàn)象第34頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）白化苗產(chǎn)生的影響因素及機(jī)理1、內(nèi)因 供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）、花粉發(fā)育時(shí)期。2、外因 預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類(lèi)、培養(yǎng)條件和方法、愈傷組織轉(zhuǎn)分化時(shí)間等。3、機(jī)理 核基因起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致質(zhì)體DNA缺失，產(chǎn)生白苗。另外地、無(wú)性系變異也可能是原因之一。（二）白化苗的控制

通過(guò)對(duì)花粉發(fā)育時(shí)期、預(yù)處理、培養(yǎng)基成分等因素進(jìn)行調(diào)控。第35頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素（一）基因型

植物基因型是影響雄核發(fā)育的最重要的因素之一。同一物種中的不同基因型對(duì)小孢子離體誘導(dǎo)反應(yīng)差異較大。如在水稻中，秈稻花粉培養(yǎng)力遠(yuǎn)低于糯稻。第36頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天小孢子發(fā)育時(shí)期對(duì)誘導(dǎo)雄核發(fā)育非常重要。（二）花粉發(fā)育時(shí)期適宜時(shí)期：?jiǎn)魏似?尤其是單核中、晚期(單核靠邊期)第37頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天蕓苔屬植物Brassicanapus不同基因型的小孢子產(chǎn)胚率比較Topas

10,000-200,000 1-20Westar 1000-10,0000.1-1Delta 100-10,000 0.01-1Bounty10-1000.001-0.01基因型 胚狀體數(shù)量/106小孢子成苗率（%）第38頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、植株生長(zhǎng)條件光溫等因素均能影響花藥培養(yǎng)力。一般處于適宜生長(zhǎng)條件（如溫室中）較好。但物種間存在差異。2、植株生長(zhǎng)時(shí)期一般是開(kāi)花始期優(yōu)于開(kāi)花末期。3、P花粉的頻率不同溫度、日照時(shí)數(shù)、氮饑餓及生長(zhǎng)物質(zhì)處理提高P花粉的數(shù)量（三）供體植株生長(zhǎng)條件和生理狀態(tài)

第39頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天隨著細(xì)胞體積迅速增大，細(xì)胞核由中央位置推向一邊，即單核靠邊期。。雄配子體的發(fā)育營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生殖細(xì)胞精子第40頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s染色單核期雙核期成熟花粉粒處于不同發(fā)育時(shí)期的煙草小孢子第41頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天單核晚期

液泡第一次有絲分裂后期雙核早期雙核中期

生殖核

生殖核營(yíng)養(yǎng)核

第42頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天一般而言，單核期（第一次有絲分裂前）對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)最敏感，為最佳培養(yǎng)期。形成雙核后，在合適的條件，主要由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞分裂產(chǎn)生胚狀體。

第43頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天不同物種誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時(shí)期發(fā)育時(shí)期物種減數(shù)分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄單核早中期石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯單核晚期荔枝、茄子、青椒、小麥單核早期至晚期煙草單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍(lán)四分孢子期至雙核期玉米第44頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)不同發(fā)育階段的花藥進(jìn)行培養(yǎng)測(cè)試確定最佳小孢子發(fā)育時(shí)期的形態(tài)特征注意形態(tài)特征會(huì)因品種、發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化處于不同發(fā)育階段的煙草花芽花粉發(fā)育時(shí)期的確定第45頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天單核期的確定：

根據(jù)細(xì)胞觀察推測(cè)，雙核期的花粉中開(kāi)始積累淀粉，不能使花粉發(fā)育成植株。通常采用醋酸洋紅或碘化鉀染色，再壓片鏡檢，以確定花粉的發(fā)育時(shí)期。

但是接種前不可能把所有的花粉都進(jìn)行一次發(fā)育時(shí)期的鏡檢，通常是按照花蕾長(zhǎng)度大小與花粉發(fā)育年齡的相關(guān)性，實(shí)際操作中取一定大小的花蕾進(jìn)行的。第46頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天A.通過(guò)顯微鏡下觀察確定小孢子發(fā)育時(shí)期

醋酸洋紅染色DAPI

染色第47頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天B.通過(guò)花蕾外部特征確定小孢子發(fā)育時(shí)期

花蕾的外部形態(tài)特征與小孢子的發(fā)育時(shí)期有一定的相關(guān)性，花蕾萼裂基部與花冠頂部之差可以作為判斷小孢子發(fā)育時(shí)期的基本指標(biāo)。

第48頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、化學(xué)物質(zhì)處理包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等進(jìn)行處理。甘露醇僅能維持滲透壓，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子營(yíng)養(yǎng)饑餓，從而使小孢子去分化。3、其它包括γ射線(xiàn)、離心、磁場(chǎng)等。

預(yù)處理方法：1、高低溫處理第49頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天（四）培養(yǎng)基

1.基本培養(yǎng)基

主要為N6和MS培養(yǎng)基。MS和H培養(yǎng)基：適合雙子葉植物花藥培養(yǎng)；B5培養(yǎng)基：適合豆科和十字花科花藥培養(yǎng)；N6培養(yǎng)基：適合禾谷類(lèi)作物的花藥培養(yǎng)。Nitsch培養(yǎng)基:適合蕓薹屬和曼陀羅屬。高濃度的NH4+顯著抑制花粉愈傷組織形成。鐵鹽對(duì)花粉胚狀體發(fā)育很重要?；钚蕴看龠M(jìn)胚狀體發(fā)育。

第50頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最適的碳源種類(lèi)及濃度的所差異。在辣椒花藥培養(yǎng)中以6%的蔗糖濃度對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)率為最高。在番茄花藥培養(yǎng)中需要量高達(dá)14％。其原因是花粉母細(xì)胞的滲透壓比花絲等體細(xì)胞高的緣故，即高濃度的蔗糖不利于藥壁、花絲等體細(xì)胞的生長(zhǎng)，而利于花粉的生長(zhǎng)。一般認(rèn)為單子葉植物比雙子葉植物需糖的濃度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麥類(lèi)作物中，麥芽糖似乎為最好的碳源。較高濃度蔗糖可誘導(dǎo)花粉形成愈傷組織；

較低濃度蔗糖可使愈傷組織分化成苗。2.碳源第51頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、激素

細(xì)胞分裂素可促進(jìn)胚狀體形成；

生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)愈傷組織形成。

細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值高時(shí)可誘導(dǎo)愈傷組織分化苗4、氨基酸5、活性碳6、pH

第52頁(yè),共58頁(yè)，2024年2月25日，星期