關于蛋白質的通性純化和表征

第一節(jié)蛋白質的性質一、蛋白質的酸堿性質蛋白質中的功能團末端α－NH2

末端α－COOH

側鏈基團所以，在某種意義上，蛋白質的化學物理性質＝AA的化學物理性質第2頁,共58頁，2024年2月25日，星期天

A．蛋白質是兩性電解質，能和酸或堿發(fā)生作用

B．蛋白質分子的可解離基團來自側鏈上的功能團，此外，還有少數(shù)的末端α-COOH,α-NH2

，若是綴合蛋白質，則在輔基成分中還可能包含可以解離的基團

C．蛋白質分子中可解離基團的pK‘和游離AA中相應基團的pK’值是完全不相同

D．蛋白質可看作一個多價離子帶電性質和數(shù)量決定于可解離基團的種類、數(shù)量溶液的pH第3頁,共58頁，2024年2月25日，星期天蛋白質等電點——對某一種蛋白質來說，在某一pH值，蛋白質所帶的正電荷與負電荷恰好相等，凈電荷為零。這一pH稱為蛋白質等電點第4頁,共58頁，2024年2月25日，星期天短肽的等電點和凈電荷量可以根據(jù)pK值計算，蛋白質的等電點要用等電聚焦等方法測定。等電聚焦電泳：這是一種特殊的電泳，其載體上鋪有連續(xù)的PH梯度的緩沖液，然后將蛋白質點樣，只要該處的PH與蛋白質的PI不同，則蛋白質就會帶電，PH值>PI時，蛋白質帶-電；PH值<PI時，蛋白質帶+電。通電后，蛋白質就會移動，直到某處的PH＝PI，蛋白質才呈電中性，不再移動，因此，可以測出PI。第5頁,共58頁，2024年2月25日，星期天蛋白質的性質與它們的結構密切相關。某些物理或化學因素，能夠破壞蛋白質的結構狀態(tài)，會使有規(guī)則的螺旋、球狀等空間結構變?yōu)闊o規(guī)則的伸展肽鏈，從而引起蛋白質理化性質改變并導致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質的變性(denaturation)。二、變性與復性第6頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1、變性的實質：

次級鍵的斷裂，所以一級結構完好2、變性蛋白質的特點：

生物活性喪失

側鏈基團暴露，水溶性降低

易被蛋白酶水解（這就是熟食易于消化的道理）3、變性因素：

物理因素：加熱、高壓、紫外線等

化學因素：有機溶劑、脲、胍、強酸、強堿第7頁,共58頁，2024年2月25日，星期天變性蛋白質通常都是固體狀態(tài)物質，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復原有蛋白質所具有的性質。所以，蛋白質的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。第8頁,共58頁，2024年2月25日，星期天3、復性：renaturation

有的蛋白質變性后，將變性劑除掉，某些蛋白質緩慢重新回復到天然構像。

例如，核糖核酸酶在β-巰基乙醇和8M尿素作用下發(fā)生的變性，經(jīng)過透析去除尿素和β-巰基乙醇，酶蛋白又可恢復其原來的構象，生物學活性也幾乎全部恢復。

許多蛋白質變性時被破壞嚴重，不能恢復，稱為不可逆性變性。

第9頁,共58頁，2024年2月25日，星期天三、蛋白質的膠體性質與蛋白質沉淀（一）、蛋白質的膠體性質

蛋白質溶液是一種分散系統(tǒng)，在這種分散系統(tǒng)中，蛋白質是分散相，蛋白質分子量很大，一般在10000-1000000之間，在水溶液中分子直徑在1-100nm之間，因此，蛋白質溶液是一種膠體溶液系統(tǒng)，從而具有膠體溶液的性質，如不能通過半透膜、電泳現(xiàn)象等。因此可用透析和電泳的方法來分離、純化蛋白質。溶液分散系統(tǒng)根據(jù)分散程度可分為3類：真溶液——分散相質點小于1nm

懸濁液——分散相質點大于100nm

膠體溶液——分散相質點介于1-100nm第10頁,共58頁，2024年2月25日，星期天（1）蛋白質的分子大小在1~100nm之間，屬于膠體質點的范圍，在動力學上是穩(wěn)定的；（2）水化層：蛋白質表面多親水基團(-COOH、-OH、-SH、-CONH2

等），具有強烈地吸引水分子作用，在水溶液中蛋白質顆粒的表面形成一層很厚的水化膜，從而阻止蛋白質顆粒的相互聚集；（3）同性電荷：在非等電點時蛋白顆粒帶有相同的凈電荷，相互排斥，與其周圍的反離子構成穩(wěn)定的雙電層。

維持蛋白質膠體穩(wěn)定性的因素：第11頁,共58頁，2024年2月25日，星期天

破壞蛋白質溶液的穩(wěn)定性，蛋白質就會凝聚成大的質點而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質沉淀。(precipitation)。

（二）、蛋白質的沉淀反應第12頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1、鹽析法沉淀蛋白質的方法

鹽析(saltingout)——加鹽使蛋白質沉淀析出的現(xiàn)象；原因：加入高濃度的中性鹽（如[H4N]2SO4、Na2SO3

、NaCl等），可有效破壞蛋白質顆粒的水化層，同時又中和了蛋白質的電荷，使蛋白質產(chǎn)生沉淀；鹽析法是最常用的分離蛋白質的方法；鹽析一般不引起蛋白質的變性，當除去鹽后又可以溶解。第13頁,共58頁，2024年2月25日，星期天

用半飽和的硫酸銨來沉淀出血清中的球蛋白，飽和硫酸銨可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出來。鹽析沉淀的蛋白質，經(jīng)透析除鹽，仍保證蛋白質的活性。調節(jié)蛋白質溶液的pH至等電點后，再用鹽析法則蛋白質沉淀的效果更好。應用：血清中的球蛋白的提取第14頁,共58頁，2024年2月25日，星期天

可與水混合的有機溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對水的親和力很大，能破壞蛋白質顆粒的水化膜，使蛋白質顆粒容易凝集而沉淀。

調節(jié)蛋白質溶液至等電點時，加入有機溶劑可加加速蛋白質沉淀。

常溫下有機溶劑沉淀蛋白質往往引起變性。在低溫條件下，則變性進行較緩慢，可用于分離制備蛋白質。2、有機溶劑沉淀蛋白質

第15頁,共58頁，2024年2月25日，星期天

當溶液pH值高于等電點時，蛋白質顆粒帶負電荷，它易與重金屬離子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）結合成不溶性鹽而沉淀。

重金屬沉淀的蛋白質通常是變性的，誤食重金屬鹽后可大量飲用牛奶或豆?jié){等蛋白質，然后用催吐劑將結合的重金屬鹽嘔吐出來解毒。

若在低溫條件下，并控制重金屬離子濃度，也可用于分離制備不變性的蛋白質。3、重金屬鹽沉淀蛋白質

第16頁,共58頁，2024年2月25日，星期天

pH小于等電點時蛋白質帶正電荷，易與帶負電（酸根陰離子）的生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、過氯酸、硝酸)生成不溶性鹽而沉淀。

血液化學分析時常利用此原理除去血液中的蛋白質，此類沉淀反應也可用于檢驗尿中蛋白質。4、生物堿試劑和某些酸類沉淀蛋白質第17頁,共58頁，2024年2月25日，星期天

將接近于等電點的蛋白質溶液加熱，可使蛋白質發(fā)生凝固而沉淀。

加熱使蛋白質變性，有規(guī)則的肽鏈結構被打開呈松散狀不規(guī)則的結構，分子的不對稱性增加，疏水基團暴露，進而凝聚成凝膠狀的蛋白塊。如煮熟的雞蛋，蛋黃和蛋清都凝固。

5、加熱凝固第18頁,共58頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)蛋白質的分離、純化和表征第19頁,共58頁，2024年2月25日，星期天一、分離提純的一般程序：

蛋白質提純的總目標--增加制品純度或比活性、幾增加單位蛋白質垂懸中所要蛋白質的含量或生物活血清中的球蛋白。分離提純蛋白質的一般程序：前處理粗分離細分離重結晶第20頁,共58頁，2024年2月25日，星期天（1）前處理細菌動物組織植物組織超聲波+砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶破碎石英砂+提取液或纖維素酶破碎電動搗碎機、勻漿器、超聲波破碎提取介質得到所要的蛋白質對于細胞核染色體、核糖體中的蛋白質分開差速離心第21頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2).

粗級分離(常用沉淀法)

主要目的是除去糖、脂類、核酸及大部分雜蛋白，并將蛋白濃縮。常用以下方法：沉淀法除鹽濃縮第22頁,共58頁，2024年2月25日，星期天（1）、硫酸銨分級鹽析硫酸銨鹽分子水化，奪走了蛋白質表面的水化層，蛋白質聚集沉淀。第23頁,共58頁，2024年2月25日，星期天（3）重金屬鹽沉淀

（4）、生物堿試劑與某些酸沉淀（2）、pI沉淀第24頁,共58頁，2024年2月25日，星期天

利用蛋白質分子不能通過半透膜的性質，使蛋白質和鹽分開。

濃縮——用凍干、超濾等方法濃縮除鹽——透析第25頁,共58頁，2024年2月25日，星期天3)、細分離

以上方法得到的制劑可供工業(yè)應用。如需高純樣品，應精制4)、結晶：蛋白質分離純化的最后步驟本身伴隨著一定程度的提純重結晶：可除去少量夾雜的蛋白質蛋白質純度愈高、溶液愈濃就愈容易結晶

樣品進一步提純的方法：凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、親和層析、電泳等。第26頁,共58頁，2024年2月25日，星期天二、蛋白質分離純化方法（1）分子大小、（2）溶解度、（3）電荷、（4）吸附性質、（5）對其他分子的生物學親和力第27頁,共58頁，2024年2月25日，星期天（一）、根據(jù)分子大小不同的純化方法1、透析和超過濾透析超過濾濾膜壓力過濾離心力過濾第28頁,共58頁，2024年2月25日，星期天在層析柱中裝入葡聚糖凝膠顆粒。這種凝膠顆粒具有多孔的網(wǎng)狀結構。這些網(wǎng)孔只允許較小的分子進入顆粒內(nèi)，而大于網(wǎng)孔的分子則被排阻。當用洗脫液洗脫時，被排阻的相對分子質量大的分子先被洗脫下來，相對分子質量小的分子后下來。2、凝膠過濾（1）、凝膠過濾的介質第29頁,共58頁，2024年2月25日，星期天

（2）、凝膠過濾的原理第30頁,共58頁，2024年2月25日，星期天（二）利用溶解度差別的分離方法影響蛋白質溶解度的主要因素：溶液的pH離子強度介電常數(shù)溫度第31頁,共58頁，2024年2月25日，星期天

蛋白質處于PI時，凈電荷為零，相鄰分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀1．等電點沉淀和PH控制

不同蛋白質

∣

↓↓

等電點不同

∣

∣PI時溶解度最低

↓

將蛋白質彼此分開第32頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2．蛋白質的鹽溶和鹽析中性鹽對球狀蛋白質的溶解度有顯著影響：鹽溶——低濃度時，中性鹽可以增加蛋白質的溶解度在等電點時，中性鹽K2SO4對一氧化碳血紅蛋白的影響第33頁,共58頁，2024年2月25日，星期天作用機理：蛋白質吸附鹽類離子，帶電表層使蛋白質分子彼此排斥，蛋白質與水分子的作用加強，溶解度提高。第34頁,共58頁，2024年2月25日，星期天原理－－大量中性鹽的加入，使水的活度降低，原來的溶液中的大部分自由水轉變?yōu)辂}離子的水化水。降低蛋白質極性基團與水分子間的相互作用，破壞蛋白質分子表面的水化層。鹽析－－當離子強度增加到足夠高時，如飽和或半飽和程度，很多蛋白質從水溶液中沉淀出來，這種現(xiàn)象叫鹽析。鹽析法－－分離、提純常用方法。保持蛋白質的天然構象。（NH4)2SO4第35頁,共58頁，2024年2月25日，星期天血清半飽和硫酸銨離心球蛋白沉淀血清離心飽和硫酸銨白蛋白沉淀研究得最多的蛋白質之一——雞蛋清的卵清蛋白就是用鹽析法得到的：第36頁,共58頁，2024年2月25日，星期天3．有機溶解分級法如果：那么變性問題在很大程度上可以得到解決第37頁,共58頁，2024年2月25日，星期天作用原理：①.有機溶劑的加入改變了介質的介電常數(shù)，增加了兩個相反電荷之間的吸引力，蛋白質的表面可離解基團的離子化程度減弱，水化程度降低，蛋白質分子聚集沉淀。②.有機溶劑與蛋白質爭奪水化水，致使蛋白質聚集體的形成并沉淀。

第38頁,共58頁，2024年2月25日，星期天4．溫度對蛋白質溶解度的影響

在40-50°C以上，大部分蛋白質變得不穩(wěn)定,開始變性，一般在中性pH介質中失去溶解力。大多數(shù)蛋白質在低溫下比較穩(wěn)定,因此蛋白質的操作一般在0°C或更低溫度下進行。

在0-40°C之間，大部分球狀蛋白質的溶解度隨溫度升高而增大。第39頁,共58頁，2024年2月25日，星期天(三)根據(jù)電荷不同的分離純化方法

根據(jù)蛋白質的電荷不同即酸堿性質不同分離蛋白質混合物的方法有電泳和離子交換層析兩類。1、電泳第40頁,共58頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)

聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的電泳方法。丙烯酰胺單體聚丙烯酰胺鏈N，N，N，N‘一四甲基乙二胺過硫酸銨交叉聯(lián)接而形成凝膠N，N’一亞甲雙丙烯酰胺調節(jié)單體的不同濃度不同程度交鏈結構第42頁,共58頁，2024年2月25日，星期天因此，蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。那么如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率是不是就取決于分子的大小，就可以用電泳技術測定蛋白質的分子量。

連續(xù)的——整個電泳系統(tǒng)中所用緩沖液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的不連續(xù)的——電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液，pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。

在聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為：第43頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1967年，Shapiro等發(fā)現(xiàn)陰離子去污劑：十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作用，當向蛋白質溶液中加入足夠量SDS和巰基乙醇，SDS可使蛋白質分子中的二硫鍵還原。由于十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質—SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別。這樣的蛋白質—SDS復合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質的分子量。

第44頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基磺酸鈉（sodiumdodecylsulfate,SDS）是一種陰離子去污劑，于100℃加熱，在β-巰基乙醇存在下，可以使大多數(shù)多聚體蛋白質的四級結構解體，并與各亞基牢固地結合，從而遮蔽了蛋白質分子上原有電荷，同時帶上強的負電荷。第45頁,共58頁，2024年2月25日，星期天

由于所有的SDS-蛋白質復合物，在電泳時都以同樣的電荷按分子量大小不同向正極移動，作SDS聚丙烯酰胺凝膠泳動（SDS）時，其泳動速度僅決定于蛋白質的分子量。SDS與蛋白質的結合是成比例的，所以SDS-蛋白質復合物在泳動中的不同速率，就反映了分子量的不同。與分子量的對數(shù)和相對遷移率成一定比例關系。使用已知分子量的標準物作標準曲線或用計算法確定標準曲線的常數(shù)，即可求出未知樣品的分子量。用這種方法測定的分子量是亞單位肽鏈的分子量。第46頁,共58頁，2024年2月25日，星期天分子量及靜電荷密度均影響泳動率只有分子量影響泳動率第47頁,共58頁，2024年2月25日，星期天

毛細管電泳技術是一種基于“不同組分在溶液中電泳遷移速度不同”的原理，利用電解槽和與之相連的毛細管對樣品組成進行分離和檢測的化學分析技術。3、毛細管電泳第48頁,共58頁，2024年2月25日，星期天4、等電聚焦

在外電場作用下，各種蛋白質將移向并聚焦在等于其等電點的pH梯度處。

第49頁,共58頁，2024年2月25日，星期天當樣品中的蛋白質泳動至相等于其pI的pH位置時，其凈電荷會變?yōu)榱?pH=pI)，因而聚焦于該處不動。因此等電聚焦是依據(jù)分子pI的不同來作分離。pH梯度制作一般利用兩性電解質Ampholyte，兩性電解質是一種混合物，含有各種連續(xù)

pI的小分子。若在聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)加入ampholyte，通電后

ampholyte會在凝膠中形成一pH梯度。第50頁,共58頁，2024年2月25日，星期天（四）利用對配體的特異生物學親和力的純化方法——親和層析

親和層析是利用生物分子間所具有的專一親和力而設計的層析技術。如抗原和抗體之間，均具有專一的親和力，在一定條件下能緊密結合成復合物，而這種結合又是可逆的，改變條件可將抗原抗體解離。第51頁,共58頁，2024年2月25日，星期天把可結合的一對分子的一方(稱配體)結合在惰性載體上使其固相化，另一方隨流動相流經(jīng)該載體，雙方即結合為一整體。然后設法將它們解離，從而得到與配體有特異結合能力的某一特定的物質。具體操作：第52頁,共58頁，2024年2月25日，星期天具備下述特性：①高度親水，②惰性載體，③具有相當量的化學基團可供活化，在溫和條件下能與較大量配體連接；④有較好的物理化學穩(wěn)定性．不易受周圍條件(加PH、離子強度、溫度、變性劑和去污劑等)的影響，⑤具有多孔的網(wǎng)狀結構，能使被親和吸附的大分子自由通過而增加配體的有效濃度；⑥有良好的機械性能，利于控制層析速度，最好是均一的珠狀顆粒。（1）載體的選擇第53頁,共58頁，2024年2月25日，星期天（2）常用的配體

抗體純化中常用的配體是抗原，此外，抗體純化中常用的配體還有蛋白A和蛋白G。第54頁,共58頁，2024年2月25日，星期天（一）名詞解釋超二級結構(super-secondarystructure）；結構域（structuraldomain,domain