實驗一葛根藥材的真實性鑒定1.1儀器生物顯微鏡[BA210、Motic]、鑷子、載玻片、蓋玻片、酒精燈、單〔雙〕面刀片、紫外分析燈〔254nm和365nm〕[WFH-203B、上海精科實業(yè)]、硅膠HF254板、層析缸、天平[JH202、上海精密科學(xué)儀器]、錐形瓶、超聲振蕩儀[SB-5200D、寧波新芝生股份]、量筒、點樣毛細管、水浴[XMTE-8112、上海精宏實驗設(shè)備]。1.2試劑水合氯醛試液、蒸餾水、稀甘油、甲醇[分析純AR批號:20120508國藥集團化學(xué)試劑]、乙酸乙酯[分析純AR批號:T20110822國藥集團化學(xué)試劑]、氯仿[分析純AR批號:20131227國藥集團化學(xué)試劑]。1.3材料待鑒定天然藥物及對應(yīng)藥材粉末各5份。5份未知藥材分別為葛根〔豆科植物野葛Puerarialobata〔Willd.〕Ohwi的枯燥根〕、粉葛〔混亂品種：豆科植物甘葛藤PuerariathomsoniiBenth.的枯燥根〕、劣質(zhì)葛根、未知生藥1〔偽品〕、未知生藥2〔偽品〕；葛根制劑愈風(fēng)寧心片；葛根素對照品、葛根對照藥材、粉葛對照藥材。2.實驗方法2.1葛根及粉葛的性狀鑒定觀察并記錄〔文字記錄及數(shù)碼采集圖像〕藥材性狀特征，鑒定其是否符合2015年版《中華人民共和國藥典》相關(guān)項下標準。葛根的性狀鑒別：完整的塊根呈圓柱形。外表褐色，具縱皺紋，可見皮孔及須根痕。質(zhì)堅實。飲片呈縱切的長方形厚片或小方塊，長5-35cm，厚0.5-1cm。外皮淡棕色，有縱皺紋，粗糙。切面黃白色，紋理不明顯。質(zhì)韌，纖維性強。氣微，味微甜。粉葛的性狀鑒定：呈圓柱形，類紡錘形或半圓柱形，長12-15cm，直徑4-8cm；有的為縱切或橫切的厚片，大小不一。外表黃白色或淡棕色，未去外皮的呈灰棕色。體重，質(zhì)硬，富粉性，橫切面可見由纖維形成的淺棕色同心性環(huán)紋，縱切面可見由纖維形成的數(shù)條縱紋。氣微，味微甜。2.2葛根、粉葛和愈風(fēng)寧心片的顯微鑒定水裝片：取少許粉末，置于載玻片中央，滴適量蒸餾水，用針將粉末分散均勻，將蓋玻片以45°夾角蓋上，用大拇指按壓蓋玻片，無氣泡最正確。用于觀察淀粉粒。水合氯醛裝片：取少許粉末，置于載玻片中央，用解剖針將粉末分散均勻，加1-2滴水合氯醛試液，在酒精燈上透化，重復(fù)2-3次透化后加半滴甘油。將蓋玻片與載玻片以45°夾角蓋上，用大拇指按壓蓋玻片，無氣泡最正確。用于觀察纖維、導(dǎo)管形態(tài)等。觀察并記錄〔文字記錄及數(shù)碼采集圖像〕原料藥粉末顯微特征，鑒定其是否符合2015年版《中華人民共和國藥典》相關(guān)項下標準，鑒定其制劑愈風(fēng)寧心片是否符合該藥品質(zhì)量標準。葛根的顯微特征：粉末淡棕色。淀粉粒單粒球形，直徑3-37μm，臍點點狀，裂縫狀或星狀；復(fù)粒由2-10分粒組成。纖維多成束，壁厚，木化，周圍細胞大多含草酸鈣方晶，形成晶纖維，含晶細胞壁木化增厚。石細胞少見，類圓形或多角形，直徑38-70μm。具緣紋孔導(dǎo)管較大，具緣紋孔六角形或橢圓形，排列極為緊密。粉葛的顯微特征：粉末黃白色。淀粉粒甚多，單粒少見，圓球形，直徑8-15μm，臍點隱約可見；復(fù)粒多，由2-20分粒組成，纖維多成束，壁厚，木化，周圍細胞大多含草酸鈣方晶，形成晶纖維，含晶細胞壁木化增厚。石細胞少見，類圓形或多角形，直徑25-43μm。具緣紋孔導(dǎo)管較大，具緣紋孔圓形，排列極為緊密。2.3葛根、粉葛及其制劑的TLC鑒別葛根素對照品溶液、天然藥物原料藥及其制劑供試品溶液的制備：①對照品溶液制備：取葛根素對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為蒸干，殘渣加甲醇0.5ml使溶解，制成對照藥材溶液。②藥材供試品溶液制備：天然藥物原料藥(5個樣品)0.1g加甲醇10ml，超聲處理20min，將上清液濾出，藥液置蒸發(fā)皿中水浴上蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。③制劑供試品制備：取愈風(fēng)寧心片2片，除去包衣，研細，加醋酸乙酯20ml，超聲處理20分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇lmL使溶解，作為供試品溶液。點樣：按照2015年版《中華人民共和國藥典》一部薄層色譜法〔附錄ⅥB〕試驗，吸取上述8種溶液各10μl，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，使成條狀。展開：以三氯甲烷-甲醇-水〔7：2.5：0.25〕為展開劑，展開，取出，晾干。結(jié)果觀察：置紫外光燈〔365nm和254nm〕下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)得位置上，顯示相同顏色的熒光條斑。記錄〔數(shù)碼照相〕實驗結(jié)果。 〔A組〕3.1性狀鑒定觀察可得，樣品A應(yīng)為葛根制劑愈風(fēng)寧心片，青綠色包衣片，除去包衣后顯棕褐色；味微苦、甜。樣品B樣品C樣品D樣品E樣品F外皮顏色淡棕色黃白色淡灰棕色黃白色白色或淡黃色形狀縱切的大小不一的小方塊縱切或斜切的大小不一的小方塊縱切的大小不一的小方塊大小不一的不規(guī)那么片狀及條狀大小不一的小方塊斷面有縱皺紋，粗糙。切面黃白色，紋理不明顯。橫切面可見由纖維形成的淺棕色同心性環(huán)紋，縱切面可見由纖維形成的數(shù)條縱紋。有縱皺紋，切面淡棕色，紋理明顯，粗糙。切面黃白色，紋理不明顯，有細小孔隙。表皮紋細、紋理不明顯，斷面白色細膩，顆粒性。氣味氣微，味微甜。氣微，味微甜。氣微，味微甜。氣微、味微澀。氣微，味微酸。其它質(zhì)韌，纖維性強。體重，質(zhì)硬，富粉性，纖維性強。質(zhì)韌，纖維性強。體重，質(zhì)硬，不易折斷。體重，質(zhì)堅實。3.2顯微鑒定樣品B樣品C樣品D樣品E樣品F顏色淡棕色黃白色淡褐色黃白色黃白色淀粉粒單粒球形，直徑3-37μm，臍點點狀、裂縫狀或星狀；復(fù)粒由2-10分粒組成。甚多，單粒少見，圓球形，直徑8-15μm，臍點隱約可見；復(fù)粒多，由2-20分粒組成。單粒球形，直徑3-37um，臍點點狀、裂縫狀或星狀；復(fù)粒由2-10多分粒組成。單粒扁卵形、類圓形、三角狀卵形或矩圓形，臍點點狀、人字狀、十字狀或短縫狀，可見層紋；復(fù)粒稀少，由2-3分粒組成。無晶纖維纖維多成束，壁厚，木化，周圍細胞多含草酸鈣方晶，形成晶纖維，含晶細胞壁木化增厚。纖維多成束，壁厚，木化，周圍細胞大多含草酸鈣方晶，形成晶纖維，含晶細胞壁木化增厚。纖維多成束，壁厚，木化，周圍細胞多含草酸鈣方晶，形成晶纖維，含晶細胞壁木化增厚。無可見顆粒狀團塊，菌絲細長，稍彎曲，有分枝，無色或帶棕色，橫壁偶可察見石細胞少見，類圓形或多角形，直徑38-70μm少見，類圓形或多角形，直徑25-43μm少見，類圓形或多角形，直徑38-70μm少見，類圓形或多角形少見，類圓形或多角形具緣紋孔導(dǎo)管較大，具緣紋孔六角形或橢圓形，排列極為緊密。較大，具緣紋孔圓形，排列極為緊密。較大，具緣紋孔六角形或橢圓形，排列極為緊密。除具緣紋孔導(dǎo)管外還有網(wǎng)紋、螺紋及環(huán)紋導(dǎo)管。無樣品B：淀粉粒晶纖維石細胞具緣紋孔導(dǎo)管樣品C：淀粉粒晶纖維石細胞具緣紋孔導(dǎo)管樣品D：淀粉粒晶纖維石細胞具緣紋孔導(dǎo)管樣品E：淀粉粒石細胞具緣紋孔導(dǎo)管樣品F：石細胞晶纖維3.3TLC鑒別123456789123456789〔254nm紫外燈下TLC圖〕〔365nm紫外燈下TLC圖〕1：葛根素對照品；2：野葛對照品；3：粉葛對照品；4：樣品A--愈風(fēng)寧心片；5-9：樣品B-F各組分比移值〔Rf〕：Rf1=0.30；Rf2=0.27、Rf2’=0.70；Rf3=0.25；Rf4=0.27、Rf4’=0.68；Rf5=0.27、Rf5’=0.67；Rf6=0.25；Rf7=0.30、Rf7’樣品8、9無明顯熒光現(xiàn)象。3.4實驗結(jié)果通過性狀鑒別、顯微鑒別、TLC鑒別及Rf值的比照，得出結(jié)論：樣品A為愈風(fēng)寧心片；樣品B為葛根；樣品C為粉葛；樣品D為劣質(zhì)葛根；樣品E為偽品1〔推測可能為天麻〕；樣品F為偽品2〔推測可能為茯苓〕?？记绊氈孩賂LC鑒別點樣時點樣量不宜過大，易造成拖尾；注意邊緣效應(yīng)，點樣時邊緣預(yù)留出一定距離。②制片時粉末不宜過大，且需分散均勻，便于觀察。性狀鑒別：觀察可得，樣品A應(yīng)為愈風(fēng)寧心。片樣品C外表黃白色，縱切面可見由纖維形成的數(shù)條縱紋，粉性強，推測為粉葛。樣品B、D外表淡棕色，推測可能葛根。E、F無此特征，推測可能為偽品。觀察其性狀，F(xiàn)雖性狀類同粉葛，無粉性，有可能為茯苓。顯微鑒別：樣品B、D可觀察到單粒球形淀粉粒；含草酸鈣方晶的晶纖維且含晶細胞壁木化增厚；少見石細胞，類圓形或多角形；較大的具緣紋孔導(dǎo)管，具緣紋孔六角形或橢圓形，推測可能為葛根。樣品C觀察到淀粉粒甚多，單粒少見，復(fù)粒多；纖維成束，周圍細胞多含草酸鈣方晶，形成晶纖維，含晶細胞壁木化增厚，推測可能為粉葛。樣品E無法觀測到晶纖維，樣品F無法觀測到淀粉粒與具緣紋孔導(dǎo)管，推測其可能為偽品。TLC鑒別：與對照品在254nm下相比擬，粉末樣品A、B、C、D對照品在相應(yīng)位置上均有顏色相同的斑點。根據(jù)斑點與對照品的比擬以及在同樣點樣量下斑點顏色深淺比擬，推論出A是愈風(fēng)寧心片，B是葛根，C是粉葛，D是劣質(zhì)葛根。E、F未顯示斑點，為偽品。總結(jié)：性狀鑒定與顯微鑒定可以推測樣品B、D為葛根，C為粉葛，E、F為偽品，。TLC鑒定可知樣品是否含葛根素以及含量上下，由此區(qū)分優(yōu)葛(B)、劣葛(D)、粉葛〔C〕和偽品1、2。綜上所述，得出結(jié)論：樣品A為愈風(fēng)寧心片；樣品B為葛根；樣品C為粉葛；樣品D為劣質(zhì)葛根；樣品E為偽品1〔推測為天麻〕；樣品F為偽品2〔推測為茯苓〕。實驗二葛根總黃酮的提取工藝研究儀器與材料旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀【RE-52AA上海亞榮生化儀器廠】、鼓風(fēng)枯燥箱、水浴鍋、煎煮鍋、玻璃層析柱、紗布、量筒、容量瓶、蒸發(fā)皿、移液管、洗耳球、電子天平【JA5002上海精天電子儀器】、乙醇、甲醇、蒸餾水豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的枯燥根【批號140206上?？禈蛑兴庯嬈?、AB-8大孔吸附樹脂取葛根〔野葛〕飲片80g，置煎煮鍋中，加10倍量水〔800ml〕，溫室浸泡半小時。大火煮沸然后小火保持微沸狀態(tài)1小時，紗布過濾提取液，藥渣用8倍量水〔640ml〕再煮沸半小時，紗布過濾提取液。合并兩次提取的濾液，混合均勻，測量總體積并記錄。精密量取0.50ml置于10.0ml容量瓶中，以30%乙醇定容〔測試樣品1〕，以備測定水提物總黃酮的含量；奇遇水煎液常壓濃縮至1g生藥/ml〔80ml〕，另精密量取5.0ml〔相當于5g生藥量〕的藥液于已經(jīng)記錄重量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，烘干稱重，計算水煎法浸膏得率。其余水煎濃縮液〔75ml〕加2倍量95%乙醇〔150ml〕，攪拌，4℃放置約1小時，沉淀。減壓抽濾，測量濾液體積，量取0.50ml置于10.0ml容量瓶中，以30%乙醇定容〔測試樣品2〕，以備測定水提醇沉純化后樣品總黃酮的含量；減壓回收剩余濾液，濃縮至2.5g生藥/ml〔30ml〕。另精密量取2.0ml相當于5g生藥量的藥液于已經(jīng)記錄重量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，烘干，稱重，計算水提醇沉純化法所得浸膏得率。剩余樣品，14ml供藥效試驗〔藥理樣品A〕、14ml供大孔樹脂實驗。取90ml已經(jīng)預(yù)處理好的大孔樹脂AB-8吸附劑，裝柱，上樣14ml〔相當于35g生藥〕葛根提取液，吸附平衡半小時。先以去離子水洗脫出去水溶性雜質(zhì)，至檢測無多糖反響為止。再以70%乙醇洗脫，收集洗脫液，至無黃酮絡(luò)合反響，測量70%乙醇洗脫液的總體積。量取0.50ml置于10.0ml容量瓶中，以備測定大孔樹脂純化后黃酮含量〔測試樣品3〕。剩余洗脫液減壓濃縮至上樣體積〔14ml，相當于2.5g生藥/ml〕，精密量取2.0ml〔相當于5g生藥量〕的藥液于已經(jīng)記錄重量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，烘干稱重，計算大孔樹脂純化法浸膏得率。表1樣品中黃酮含量測試總體積(ml)樣品體積(ml)稀釋倍數(shù)吸光度A樣品濃度(μg/ml)總黃酮含量(mg)測試樣品1715500測試樣品22021250測試樣品31061000表2不同提取純化工藝結(jié)果的比擬提取方法浸膏得率(%)總黃酮含量(%)總黃酮提取率(%)水提水提醇沉大孔樹脂純化44.討論與小結(jié)天然藥物中化學(xué)成分的組成一般比擬復(fù)雜，往往有效成分和其他雜質(zhì)共存，各成分含量差異也比擬大。別離純化技術(shù)有利于提高產(chǎn)品有效成分的含量，確保天然藥物的質(zhì)量、療效和穩(wěn)定性。常用的提取方法有浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取