關(guān)于血液分子生物學(xué)基因治療基因治療（Genetherapy

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基因治療（Genetherapy

）：指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達(dá)到治療的目的。為達(dá)到這一目的，實施相應(yīng)的策略。第2頁,共60頁，2024年2月25日，星期天一、基因治療策略策略：直接基因治療和間接基因治療1、直接基因治療：糾正突變基因

在原位修復(fù)缺陷的基因，以達(dá)到治療目的。為較理想的基因治療策略，由于存在某些問題，目前正在努力之中。（未實現(xiàn)）第3頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2、間接療法：以正常的基因替代致病基因。

導(dǎo)入外源正?；?，代替有缺陷的基因,使細(xì)胞恢復(fù)正常功能而達(dá)到治療疾病（尤其是遺傳?。┑哪康?。而對靶細(xì)胞而言，沒有去除或修復(fù)有缺陷的基因。

第4頁,共60頁，2024年2月25日，星期天途徑

就基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞不同，基因治療有兩種途徑：

1、生殖細(xì)胞基因治療

2、體細(xì)胞基因治療第5頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

1、生殖細(xì)胞基因治療將正常基因轉(zhuǎn)移到患者生殖細(xì)胞（精細(xì)胞，卵細(xì)胞，早期胚胎）使其發(fā)育成正常個體。為理想的治療方法，從根本上治療遺傳病，使其有害基因不能在人群中散播。

第6頁,共60頁，2024年2月25日，星期天但還存在某些問題：（1）靶細(xì)胞的遺傳修飾至今尚無實質(zhì)性進展；（2）基因轉(zhuǎn)移效率不高，只能用顯微注射方法；（3）只適用于排卵周期短而次數(shù)多的動物，很難適用于人類。（但目前輔助生殖技術(shù)的發(fā)展較為有效的解決了獲取卵細(xì)胞的辦法。一次可獲取少者3-5個，多者十幾個。）第7頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2．體細(xì)胞基因治療

somaticcellgenetherapy

將正?；蜣D(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。但有害基因能遺傳給后代。第8頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

措施：（1）正常基因轉(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)的體細(xì)胞，有效表達(dá)后，再回輸?shù)襟w內(nèi)。（2）正常基因?qū)氚屑?xì)胞，定位整合到染色體上，準(zhǔn)確的替換異?；颍抢硐氲拇胧?。（3）隨機整合，非特定座位，只要有效的表達(dá)即可達(dá)到治療的目的。（4）體細(xì)胞基因治療理論上不必矯正所有的體細(xì)胞。第9頁,共60頁，2024年2月25日，星期天存在的問題

對特定座位基因轉(zhuǎn)移，目前還存在較大困難；隨機插入可能引起后代的基因突變。第10頁,共60頁，2024年2月25日，星期天二、基因治療的方法基因治療的關(guān)鍵性步驟----

目的基因的獲得與轉(zhuǎn)移

第11頁,共60頁，2024年2月25日，星期天基因治療首先獲得目的基因，通常從基因組中分離

基因克隆↓定位↓表達(dá)↓評價表達(dá)情況（一）目的基因的獲得—

正?；虻姆蛛x與克隆第12頁,共60頁，2024年2月25日，星期天（二）外源基因的轉(zhuǎn)移通過不同方法，將目的基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞。第13頁,共60頁，2024年2月25日，星期天（1）物理方法1）電穿孔法（electroporotion）將細(xì)胞置于高壓脈沖電場中，通過電壓使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔。周圍基質(zhì)中的DNA可滲進細(xì)胞，進而表達(dá)。

瞬間細(xì)胞細(xì)胞膜核膜通透性增加

高壓脈沖

DNA滲入細(xì)胞第14頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2）顯微注射法（microinjection）利用顯微操作把目的基因直接注入靶細(xì)胞

第15頁,共60頁，2024年2月25日，星期天常用的細(xì)胞（1）受精卵：受精卵→基因操作→注射假孕動物子宮→胚胎→個體。（2）胚胎干細(xì)胞：從著床前的動物胚胎中分離多功能胚胎干細(xì)胞→基因操作→注射入動物囊胚→形成嵌合體胚胎→嵌合個體。

第16頁,共60頁，2024年2月25日，星期天用顯微注射儀將外源基因直接注射入實驗動物受精卵中，利用外源基因整合到DNA中，從而得到轉(zhuǎn)基因動物。特點：導(dǎo)入速度快，操作步驟不復(fù)雜，對DNA大小無限制，不需要載體，整合效率較高，它可以直接獲得純系。缺點：需要貴重精密儀器，技術(shù)操作較難，并且外源基因的整合位點和整合的拷貝數(shù)都無法控制，易造成宿主動物基因組的插入突變，引起相應(yīng)的性狀改變，重則致死。第17頁,共60頁，2024年2月25日，星期天例：轉(zhuǎn)基因動物的制備

重組基因DNA

微注射（體外）

小鼠受精卵回植假妊娠

仔鼠

動物模型：轉(zhuǎn)基因鼠

(每個鼠細(xì)胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳)第18頁,共60頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共60頁，2024年2月25日，星期天clonesheepDolly體細(xì)胞提取核重組細(xì)胞回植Dolly卵細(xì)胞去核細(xì)胞第20頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

轉(zhuǎn)基因動物研究大事記

1974年，美國學(xué)者Jaenisch應(yīng)用顯微鏡注射法把基因?qū)胝婧思?xì)胞。

1981年，美國科學(xué)家將外源基因?qū)雱游锱咛?，?chuàng)立了轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)。

1982年獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。

1987年，世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因綿羊在英國著名的羅斯林研究所誕生。這只轉(zhuǎn)基因母羊的乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶。

第21頁,共60頁，2024年2月25日，星期天3）微粒子轟擊法

利用亞微粒的鎢和金能吸附DNA，并將其包裹起來形成微粒，通過物理途徑使微粒瞬間既可進入靶細(xì)胞，達(dá)到轉(zhuǎn)移目的基因的目的，而不損傷靶細(xì)胞。該方法可使目的基因在皮膚、肝、胰、胃及乳腺等細(xì)胞中表達(dá)。第22頁,共60頁，2024年2月25日，星期天（2）化學(xué)法磷酸鈣沉淀法：目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，易通過細(xì)胞膜進入細(xì)胞內(nèi)，并整合到受體細(xì)胞基因組中，在適當(dāng)條件下得以表達(dá)。第23頁,共60頁，2024年2月25日，星期天磷酸鈣+DNA→混合微細(xì)顆?！?/p>

沉淀反應(yīng)20~30min

↓

細(xì)胞在沉淀物中暴露5~24h

方法簡單，但轉(zhuǎn)化效率低。第24頁,共60頁，2024年2月25日，星期天（3）脂質(zhì)體法（liposome）應(yīng)用人工制備的類似細(xì)胞膜的膜性結(jié)構(gòu)——脂質(zhì)體，包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞，使其表達(dá)。

DNA細(xì)胞融合轉(zhuǎn)化細(xì)胞

PEG

仙苔病毒DNA脂膜第25頁,共60頁，2024年2月25日，星期天（4）同源重組法

同源重組（homologusrecombination）:外源基因和染色體上的基因在同源序列間發(fā)生重組而插入染色體。

是將外源基因定位導(dǎo)入細(xì)胞的染色體上。

單交換

雙交換

第26頁,共60頁，2024年2月25日，星期天通過同源重組定點插入珠蛋白基因XbaIBstXIXbaIδβ△βneoXbaIBstXIδΔββneo正常基因座位帶有珠蛋白基因的質(zhì)粒

C重組后，插入外源基因片段帶有——neo基因（新霉素抗性基因），重組后的細(xì)胞在含有neo的培養(yǎng)基中生長，沒有插入新基因的細(xì)胞死亡，將有重組的細(xì)胞篩選出來。第27頁,共60頁，2024年2月25日，星期天（5）病毒介導(dǎo)基因內(nèi)轉(zhuǎn)移（Viralmediatedtransfer）是通過病毒為載體（vector），將外源基因通過重組技術(shù)與病毒重組，然后去感染受體細(xì)胞感染細(xì)胞重組病毒第28頁,共60頁，2024年2月25日，星期天病毒載體病毒具有一些獨特的性質(zhì)如多數(shù)病毒可感染特異的細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)不易降解；RNA病毒能整合到染色體以及基因表達(dá)水平較高等。因此病毒載體是良好的基因轉(zhuǎn)運載體；目前已被用作載體的病毒有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒和肝炎病毒等。第29頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

病毒的分類（1995年）*DNA病毒*RNA病毒*逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒的增殖（復(fù)制）*吸附與穿入：細(xì)胞膜表面的特異性受體。*脫殼：溶菌酶作用下，病毒體釋放出基因組核酸。*生物合成：病毒核酸的復(fù)制及蛋白質(zhì)的合成。*轉(zhuǎn)配與釋放：復(fù)制出子代病毒的核酸與蛋白質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)裝配為成熟的病毒體；并從宿主細(xì)胞釋放。

第30頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA)

常用的病毒載體

DNA病毒

1)逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）

目前應(yīng)用最多、最成功.病毒感染細(xì)胞后，其基因組RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DNA拷貝，插入宿主染色體形成前病毒（provirus），前病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的正鏈既是病毒RNA，再與前病毒編碼的外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。第31頁,共60頁，2024年2月25日，星期天例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因組結(jié)構(gòu)：

LTRLTRψgagpolenvU3RU5U3RU5

U3=增強子，R=啟動子，U5=轉(zhuǎn)錄起始位點。

Ψ=病毒包裝信號，gag=核心抗原，pol=逆轉(zhuǎn)錄酶，env=外殼蛋白。第32頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建的技術(shù)路線

*

gag,pol,env序列去除，保留LTR和Ψ，使逆轉(zhuǎn)錄病毒成為無復(fù)制能力的缺陷病毒。

*在gag,pol,env序列去除的區(qū)域，插入目的基因序列和報告基因序列（如GFP)。

*將目的基因、其兩端的LTR以及Ψ這一序列插入經(jīng)改造的質(zhì)粒內(nèi)。

*將gag-pol序列插入經(jīng)改造的質(zhì)粒

*將env序列插入經(jīng)改造的質(zhì)粒第33頁,共60頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)粒

*

是位于細(xì)菌內(nèi)的雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，獨立于細(xì)菌染色體之外進行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。

*他們又依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)來進行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。

*質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括對抗生素的抗性、產(chǎn)抗生素、降解復(fù)雜有機化合物等。第34頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

ori5’LTR

Ψ目的基因

標(biāo)記基因3’LTR抗生素基因第35頁,共60頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共60頁，2024年2月25日，星期天逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點：①高效感染宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率可達(dá)100%②病毒基因和所載的外源基因都可能表達(dá)③宿主范圍廣，可同時感染大量細(xì)胞并長期存留第37頁,共60頁，2024年2月25日，星期天缺點

①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；②病毒隨機插入靶細(xì)胞基因組中，因病毒具有強大的啟動子和增強子，能使插入點附近的基因過度表達(dá)或失活，插入的外源基因可能不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)；第38頁,共60頁，2024年2月25日，星期天③逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用，可能使受體細(xì)胞癌變。

根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒的缺點，人們有目的地將其改造，保留其優(yōu)點，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包裝信號。第39頁,共60頁，2024年2月25日，星期天（6）受體載體轉(zhuǎn)移法將含有目的基因的重組質(zhì)粒和某些細(xì)胞表面受體能識別的特異性多肽（配體）形成復(fù)合物，通過細(xì)胞內(nèi)吞途徑達(dá)到轉(zhuǎn)移基因的目的。重組質(zhì)粒配體細(xì)胞膜復(fù)合物第40頁,共60頁，2024年2月25日，星期天（三）靶細(xì)胞的選擇靶細(xì)胞是指接受外源Gene的體細(xì)胞選擇靶細(xì)胞的原則是：1）便于體外培養(yǎng)和進行遺傳技術(shù)操作；2）易于由人體分離又便于輸回體內(nèi)；3）具有增殖優(yōu)勢，生命周期長（能存活幾月至幾年，或整個生命周期）；4）易于受外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化。第41頁,共60頁，2024年2月25日，星期天常見的靶細(xì)胞外周血T淋巴細(xì)胞上皮細(xì)胞內(nèi)皮皮膚成纖維細(xì)胞造血干細(xì)胞——β地中海貧血、嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷病等基因治療肝細(xì)胞——家族性高膽固醇血癥、低密度脂蛋白病的基因治療肌細(xì)胞第42頁,共60頁，2024年2月25日，星期天三、基因治療的現(xiàn)狀與前景體細(xì)胞基因治療臨床實驗已經(jīng)開始，生殖細(xì)胞基因治療正在完善。進行基因治療必須具備下列條件：第43頁,共60頁，2024年2月25日，星期天具備下列條件選擇適當(dāng)?shù)募膊?，清楚疾病的發(fā)病機理，基因的結(jié)構(gòu)和功能。目的基因已克隆，并清楚基因表達(dá)與調(diào)控機制與條件。選擇適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞并在體外有效表達(dá)。安全有效的基因轉(zhuǎn)移方法，以及供利用的動物模型。第44頁,共60頁，2024年2月25日，星期天基因治療實例1、復(fù)合免疫缺陷綜合征的基因治療（人類Gene治療成功例子）ADA缺乏癥-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脫氨酶（ADA）缺乏。第45頁,共60頁，2024年2月25日，星期天ADA-Gene+vector（逆轉(zhuǎn)錄病毒）

重組分子患者TLyCIL-2刺激C分裂導(dǎo)入細(xì)胞生長分裂

10天

Gene表達(dá)

回輸患兒體內(nèi)

1~2月治療一次,10個月患兒體內(nèi)ADA水平達(dá)正常人的25%

第46頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2、乙型血友病XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。臨床表現(xiàn)，易出血，凝血時間長，輕傷、小手術(shù)后常出血不止。發(fā)病率為1/30000。例如：我國學(xué)者薛京倫實施的FⅨ的基因治療。第47頁,共60頁，2024年2月25日，星期天逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

+FⅨcDNA

重組體

5`LTRFⅨneoSVPSOLTR3`①導(dǎo)入倉鼠細(xì)胞（CHO）→FⅨ表達(dá)；②導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培養(yǎng)）→FⅨ表達(dá)；③91年，導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培養(yǎng)）→回植病人皮下→FⅨ基因表達(dá)，F(xiàn)Ⅸ基表達(dá)水平達(dá)正常人的5%。是我國基因治療成功的例子。第48頁,共60頁，2024年2月25日，星期天3、黑色素瘤的基因治療腫瘤基因治療是人們十分關(guān)注的問題，進行了廣泛的探索。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞——TIL，它積聚腫瘤部位，并在該處持續(xù)存在而無副作用，利用此特點協(xié)助治療腫瘤。第49頁,共60頁，2024年2月25日，星期天例：細(xì)胞因子基因治療和腫瘤壞死因子基因治療

①IL-2Gene②TNF-Gene

（白介2）

（腫瘤壞死因子）

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入

TIL（體外培養(yǎng)的自體細(xì)胞）回植患者體內(nèi)

TIL進入自體腫瘤部位，提高細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。第50頁,共60頁，2024年2月25日，星期天4、自殺基因的基因治療X

原理：即用（逆轉(zhuǎn)錄）病毒載體將編碼某種酶的基因（自殺基因）轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中，此酶可將一種無害的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒復(fù)合物，進而殺傷腫瘤細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞不能復(fù)制而死亡）。這種基因載體只能在特定的組織或腫瘤中表達(dá)，而正常細(xì)胞中不表達(dá)。第51頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

自殺基因(suicidegene)是一類前體藥物轉(zhuǎn)換酶基因，其編碼的特異性酶類將原先對細(xì)胞無毒或毒性極低的前體藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝成毒性產(chǎn)物，從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。目前研究過的自殺基因有十余種，最常用的是HSV-TK/GCV和CD/5-FC兩種自殺基因系統(tǒng)。4、自殺基因的基因治療第52頁,共60頁，2024年2月25日，星期天如：自殺基因+病毒載體

轉(zhuǎn)染重組載體

藥物前體無毒Gene→酶→↓

藥物復(fù)合物有毒

細(xì)胞死亡第53頁,共60頁，2024年2月25日，星期天例如：

單純皰疹病毒

哺乳動物細(xì)胞

HSVGene-TK

（在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，正常細(xì)胞中不表達(dá)）Gene—TKGCV（胸苷類似物）

TdRPpGCV---p

抑制DNA合成脫氧胸苷酸

腫瘤細(xì)胞死亡鄰近細(xì)胞死亡/凋亡（旁觀者效應(yīng)）第54頁,共60頁，2024年2月25日，星期天5、反義核酸基因治療反義技術(shù)：是