關(guān)于微生物的進化系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定目的要求：通過本章學(xué)習(xí)，要求學(xué)生掌握：1、進化指征的選擇2、微生物分類學(xué)的基本知識

3、微生物的分類鑒定方法重點：

微生物的分類依據(jù)及方法。難點：代表原核微生物的拉丁學(xué)名和主要特點。

第2頁,共59頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)微生物的進化和系統(tǒng)發(fā)育

微生物分類是按微生物的親緣關(guān)系和相似程度把微生物歸入各分類單元或分類群(taxon)，以得到一個反映微生物進化的自然分類系統(tǒng)、可供鑒定用的檢索表以及可給出符合邏輯的名稱的命名系統(tǒng)。所以微生物分類的具體任務(wù)就是分類（classification）、鑒定（identification）與命名（nomenclature）。

第3頁,共59頁，2024年2月25日，星期天一、進化的測量指征1.合適的進化指征應(yīng)滿足的條件存在的普遍性序列的同源性序列的線性序列的保守性蛋白質(zhì)、RNA和DNA序列進化變化的顯著特點是進化速率相對恒定，也就是說，分子序列進化的改變量(氨基酸或核苷酸替換數(shù)或替換百分率)與分子進化的時間成正比。大量的資料表明：功能重要的大分子、或者大分子中功能重要的區(qū)域，比功能不重要的分子或分子區(qū)域進化變化速度低。第4頁,共59頁，2024年2月25日，星期天16SrRNA被普遍公認(rèn)為是一把好的譜系分析的“分子尺”或“分子計時器”：1）rRNA具有重要且恒定的生理功能；2）在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究；3）16SrRNA分子量大小適中(1540nt)，便于序列分析；4）rRNA在細(xì)胞中含量大(約占細(xì)胞中RNA的90%)，也易于提?。?）16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同源分子是18SrRNA)。因此它可以作為測量各類生物進化的工具。2.rRNA作為進化的指征缺陷：rRNA普遍高的保守性使得其在相近種、型分類鑒定時分辨力較差；操作相對較復(fù)雜。第5頁,共59頁，2024年2月25日，星期天3.rRNA的順序和進化培養(yǎng)微生物提取總的DNA作為模板rDNA序列測定分析比較微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系PCR反應(yīng)擴增16SrDNA片段第6頁,共59頁，2024年2月25日，星期天4.基于rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹系統(tǒng)發(fā)育樹（phylogenetictree）：在研究生物進化和系統(tǒng)分類中，用以概括各種（類）生物之間親緣關(guān)系的樹狀分枝的圖形。分為有根樹和無根樹兩種。一般系統(tǒng)發(fā)育樹伍斯等根據(jù)某些代表生物16SrRNA(或18SrRNA)序列比較，首次提出了一個涵蓋整個生命界的系統(tǒng)樹。這是一顆有根樹，rRNA序列分析表明，它最初先分成兩支：一支發(fā)展成為今天的細(xì)菌(真細(xì)菌)；另一支是古生菌--真核生物分支，進化過程中進一步分叉分別發(fā)展成古生菌和真核生物。第7頁,共59頁，2024年2月25日，星期天Eubacteria（真細(xì)菌界）Archaebacteria

（古細(xì)菌界）

Eukarya

（真核生物界）CarlWoese利用16SrRNA建立分子進化樹第8頁,共59頁，2024年2月25日，星期天進化樹意義：將生物分為三界（細(xì)菌、古生菌、真核生物）隨著資料的進一步積累，系統(tǒng)樹還會做進一步修改生物間存在廣泛的水平的或橫向的基因交換基因的垂直傳遞不是影響生物進化的唯一過程CarlWoose的rRNA進化樹完美無缺？第9頁,共59頁，2024年2月25日，星期天界（Kingodm）門(phylum)

(亞門)

綱(Class)

(亞綱)目(order)(亞目)科(family)(亞科)族(group)(亞族)屬(genus)(亞屬)種(species)微生物分類的基本單位是“種”第二節(jié)微生物的分類單元和命名一、生物的分類單元第10頁,共59頁，2024年2月25日，星期天種：分類特征高度相似、而又與同屬內(nèi)的其它種存在明顯差異的菌株群。微生物的種具有如下特征:1.形態(tài)、生理特征相同。2.有共同的起源。3.是分類的基本單位，也是進化的單位。4.是繁殖的單位，同種才能產(chǎn)生后代，不同的種不能產(chǎn)生后代。5.種有遺傳的穩(wěn)定性，同時也存在變異性。6.目前，DNA同源性在70%以上，16srRNA同源性達97%以上的菌株定位一個種第11頁,共59頁，2024年2月25日，星期天1、亞種（subspecies，subsp，ssp．）是種的進一步細(xì)分的單元，是正式分類單元中最低的分類等級。一般是指菌種在某一個特征上與模式種有明顯而穩(wěn)定的差異，但又不足以區(qū)分為新種。2、型（type）

是同一細(xì)菌種內(nèi)顯示很小生物化學(xué)與生物學(xué)差異的菌株，常用于細(xì)菌（尤其是致病菌）中緊密相關(guān)菌株的區(qū)分。

化學(xué)型(chemovar):產(chǎn)生某種化合物或其產(chǎn)量異常。致病型(pathovar):對一個或多個寄主的致病反應(yīng)。噬菌體型(phayovar):對噬菌體的反應(yīng)。血清型(serovar):抗原特性。

種以下的分類術(shù)語：第12頁,共59頁，2024年2月25日，星期天4、菌株（strain）從自然界中分離得到的任何一種微生物的純培養(yǎng)物都可以稱為微生物的一個菌株；用實驗方法（誘變等）所獲得的某一菌株的變異型，也可以稱為一個新的菌株，以便與原來的菌株相區(qū)別。3、群（population)：在自然界中有些微生物的種類其特征介于兩個種之間,彼此不易嚴(yán)格區(qū)分,于是我們就把這兩個種和介于它們中間的一些微生物統(tǒng)稱為一個“群”。第13頁,共59頁，2024年2月25日，星期天8、克隆:是從單個親本細(xì)胞得來的細(xì)胞群體。

6、培養(yǎng)物：指一定時間一定空間內(nèi)微生物的細(xì)胞群或生長物。7、純培養(yǎng)物：某一培養(yǎng)物是由單一微生物細(xì)胞繁殖產(chǎn)生的，就稱為該微生物的純培養(yǎng)物。5、標(biāo)準(zhǔn)菌株：又稱模式菌株，通常是人們最先發(fā)現(xiàn)，并進行過描述具有典型特征的菌株。第14頁,共59頁，2024年2月25日，星期天1新種的命名不應(yīng)與已發(fā)表的真菌，藻類、原生動物同名。2.種名要用拉丁文,用雙名法表示，新種要有典型菌株，新屬要有典型種，并要同時發(fā)表菌種的保藏號。3.新種(屬)要在“國際系統(tǒng)分類細(xì)菌學(xué)雜志”(IJSB)上發(fā)表。4.菌名的更改要得到仲裁委員會同意，并發(fā)表在IJSB上才能有效。

國際細(xì)菌命名法規(guī)

：二、微生物的命名第15頁,共59頁，2024年2月25日，星期天雙名法規(guī)定:一個生物的種名,由“屬名+種名”構(gòu)成，用斜體表示。原核微生物的學(xué)名，除了“屬名+種名”外，還要在學(xué)名后面用正體寫出最先定名的人名和時間(年代)。

StaphylococcusaureusRosenbach1884如果發(fā)現(xiàn)了一個原核生物，通過初步研究只知屬于哪一個屬，不知是何種時可用下列方式表示：屬名+sp.(單數(shù))或spp(復(fù)數(shù))。

“雙名法”種名用來描述顏色、形狀、來源或科學(xué)家的名字。種名第一個字母小寫。如：Escherichiacoli屬名用來描述主要特征、構(gòu)造或者科學(xué)家的名字。屬名第一個字母要大寫。第16頁,共59頁，2024年2月25日，星期天新名稱的發(fā)表Gilvimarinuschinensis

gen.nov.,sp.nov.

中國黃海菌

Wenxiniamarinagen.nov.,sp.nov以中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳文新院士名字命名的新屬Corynebacteriummarinumsp.nov.

海洋棒狀桿菌第17頁,共59頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)微生物在自然界的地位生物的界級分類學(xué)說：是在認(rèn)識發(fā)展過程中存在的對生物分類的不同階段的不同觀點。如：二界系統(tǒng)、三界系統(tǒng)、四界系統(tǒng)、五界系統(tǒng)、六界系統(tǒng)和三原界系統(tǒng)。陰影部分為微生物第18頁,共59頁，2024年2月25日，星期天五界系統(tǒng)真菌植物動物原生生物原核生物惠特克(Whittaker，1969)在前人分類研究的基礎(chǔ)上提出了生物的五界系統(tǒng)。第19頁,共59頁，2024年2月25日，星期天三原界系統(tǒng)Woese（1977）對16SrRNA核苷酸順序的同源性進行測定后，1978年由R．H．Whittaker和L．Margulis提出了一個嶄新的三原界（Urkingdom）學(xué)說。

所有生物存在一個共同祖先，由它分三條進化路線，就形成了三個原界：古細(xì)菌原界（Archaebacter）、真細(xì)菌原界、真核生物原界。該系統(tǒng)樹表明古生菌和真核生物屬“姊妹群”，它們之間的關(guān)系比它們與真細(xì)菌之間的關(guān)系更密切。三原界學(xué)說還吸收了關(guān)于真核生物是起源于原核細(xì)胞間的內(nèi)共生即“內(nèi)共生學(xué)說”的精髓，并使其內(nèi)容更加完善了。系統(tǒng)地提出內(nèi)共生學(xué)說者主要是Margulis。她在《真核細(xì)胞的起源》（1970）一書中，曾論述了真核細(xì)胞進化中的線粒體、葉綠體和鞭毛的共生起源。

第20頁,共59頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共59頁，2024年2月25日，星期天古生菌真核生物真細(xì)菌三原界系統(tǒng)第22頁,共59頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌的分類和伯杰氏手冊原核生物分類系統(tǒng)綱要——伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊真菌界分類系統(tǒng)很多，各國采用不同的系統(tǒng)，比較混亂。近年來為較多人接受的是Ainsworth的綱要。第23頁,共59頁，2024年2月25日，星期天

關(guān)于細(xì)菌的分類系統(tǒng)，世界比較權(quán)威的細(xì)菌分類系統(tǒng)有三個：①、前蘇聯(lián)克拉西尼柯夫系統(tǒng)②、法國的普雷沃系統(tǒng)③、美國的伯杰氏系統(tǒng)一、細(xì)菌的分類系統(tǒng)第24頁,共59頁，2024年2月25日，星期天《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》美國賓夕法尼亞大學(xué)的細(xì)菌學(xué)教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937)1957年第七版后，由于越來越廣泛地吸收了國際上細(xì)菌分類學(xué)家參加編寫(如1974年第八版，撰稿人多達130多位，涉及15個國家；現(xiàn)行版本撰稿人多達300多人，涉及近20個國家)，所以它的近代版本反映了出版年代細(xì)菌分類學(xué)的最新成果，因而逐漸確立了在國際上對細(xì)菌進行全面分類的權(quán)威地位。第25頁,共59頁，2024年2月25日，星期天《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(Bergey’sManualofSystematicBacteriology)伯杰氏手冊是目前進行細(xì)菌分類、鑒定的最重要依據(jù)，其特點是描述非常詳細(xì)，包括對細(xì)菌各個屬種的特征及進行鑒定所需做的實驗的具體方法。（20世紀(jì)80年代末期）《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》(Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology)第26頁,共59頁，2024年2月25日，星期天1、《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第一版（1984－1989）的分類《系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第一版增加了一些核酸雜交、16SrRNA寡核苷酸序列等系統(tǒng)發(fā)育方面的資料。但總體上，細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育資料較零碎，未能按照界、門、綱、目、科、屬、種系統(tǒng)分類體系進行安排，而是從實用需要出發(fā)，主要根據(jù)表型特征將整個原核生物分為33組，以4卷進行安排。第27頁,共59頁，2024年2月25日，星期天

《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(第九版)》將原核微生物分為35群，歸納為四大類(或四個門)：第一類，具細(xì)胞壁的革蘭氏陰性真細(xì)菌；第二類，具細(xì)胞壁的革蘭氏陽性真細(xì)菌；第三類，無細(xì)胞壁的真細(xì)菌；第四類，古細(xì)菌。2、《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》(第九版)（1994）的分類第28頁,共59頁，2024年2月25日，星期天《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第二版將原核生物分為古細(xì)菌和真細(xì)菌2個界，下設(shè)25門，39綱，89目，207科，包括852屬，5000余種，分為五卷本出版。2、《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第二版（2001）第一卷，古菌、藍(lán)細(xì)菌、綠色光合細(xì)菌和最先分化的屬第二卷，變形細(xì)菌第三卷，低G＋C含量的革蘭氏陽性細(xì)菌第四卷，高G＋C含量的革蘭氏陽性細(xì)菌第五卷，浮霉?fàn)罹?、螺旋體、絲桿菌、擬桿菌和梭桿菌第29頁,共59頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共59頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共59頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共59頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共59頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共59頁，2024年2月25日，星期天Ainsworth系統(tǒng)真菌界黏菌門真菌門鞭毛菌亞門接合菌亞門子囊菌亞門擔(dān)子菌亞門半知菌亞門二、真菌的分類系統(tǒng)第35頁,共59頁，2024年2月25日，星期天安斯沃思(Ainsworth,1973)的分類系統(tǒng)：

真菌界的門和亞門分類檢索表1有原生質(zhì)團或假原生質(zhì)團………………粘菌門Mycomycota

1無原生質(zhì)團或假原生質(zhì)團，同化階段為典型的菌絲體

………真菌門Eumycota

2有能動細(xì)胞(游動孢子或游動配子)，有性階段產(chǎn)生典型的卵孢子…鞭毛菌亞門Mastigomycotina

2無能動細(xì)胞

3有有性階段

4有性階段產(chǎn)生接合孢子……接合菌亞門Zygomycotina

4有性階段產(chǎn)生子囊孢子……子囊菌亞門Ascomycotina

4有性階段產(chǎn)生擔(dān)子孢子……擔(dān)子菌亞門Basidiomycotina

3無有性階段……半知菌亞門Deuteromycotina

第36頁,共59頁，2024年2月25日，星期天Ainsworth系統(tǒng)各主要類群的特征類群是否有隔膜無性孢子形成有性孢子形成低等真菌鞭毛菌亞門無可運動的游動孢子合子、卵孢子接合菌亞門無非游動性的孢囊孢子接合孢子高等真菌子囊菌亞門有分生孢子子囊孢子擔(dān)子菌亞門有罕見擔(dān)孢子半知菌亞門有分生孢子無第37頁,共59頁，2024年2月25日，星期天真菌詞典（1995）第8版的分類體系：

真菌界（Fungi）

子囊菌門（Ascomycota）

擔(dān)子菌門（Basidiomycetes）

擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）

冬孢菌綱（Teliomycetes）

黑粉菌綱（Ustomycetes）

壺菌門（Chytridiomycetes）

接合菌門（Zygomycota）

毛菌綱（Trichomycetes）

接合菌綱（Zygomycetes）

第38頁,共59頁，2024年2月25日，星期天第3節(jié)微生物的分類鑒定方法主要步驟：純化、測定一系列必要的指標(biāo)、查找權(quán)威性鑒定手冊鑒定技術(shù)的不同水平：細(xì)胞的形態(tài)和習(xí)性：形態(tài)特征、運動、酶反應(yīng)、營養(yǎng)要求及生長條件等細(xì)胞組分水平：細(xì)胞壁成分、氨基酸庫、脂類、醌類、光合色素等的分析蛋白質(zhì)水平：氨基酸序列分析、凝膠電泳和血清學(xué)反應(yīng)等基因或DNA水平：核酸分子雜交、（G+C）mol%、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)、16SrRNA寡核苷酸序列分析、DNA或RNA核苷酸序列分析等第39頁,共59頁，2024年2月25日，星期天一、傳統(tǒng)分類法

根據(jù)微生物形態(tài)、生理生化、生態(tài)和抗原等表型特征進行分類的方法，這是微生物分類鑒定中通常采用的方法。

1、形態(tài)特征:(1)形狀:球狀、桿狀、弧形、絲狀、分枝及特殊形狀(2)大小:菌體寬×長或者直徑大小(3)排列:單個、成對、成鏈或其他的特殊排列方式(4)革蘭染色反應(yīng):

G+、G—,G不定。(5)細(xì)胞內(nèi)含物:聚β-羥基丁酸、異染粒、硫粒等。(6)鞭毛與運動性:有無鞭毛、鞭毛著生位置、菌體運動性第40頁,共59頁，2024年2月25日，星期天(7)莢膜有無。(8)芽胞:有無、形狀、著生位置、孢囊是否膨大(10)孢子:孢子形狀、數(shù)量、排列(11)其他：a.藍(lán)細(xì)菌的異形胞b.鞘細(xì)菌有鞘:c.柄細(xì)菌有柄:d.粘細(xì)菌形成子實體:(12)菌落特征：包括形狀、大小、邊緣、表面及質(zhì)地、隆起程度、易挑取性或粘稠度、透明度與色澤等。

(13)液體培養(yǎng)特征：包括生長量、生長類型與分布、混濁度、表面生長狀態(tài)、沉淀物、氣味和顏色等。

第41頁,共59頁，2024年2月25日，星期天2、生理生化特征營養(yǎng)類型：光能自養(yǎng)、光能異養(yǎng)、化能自養(yǎng)、化能異養(yǎng)氮源：蛋白質(zhì)、蛋白胨、氨基酸、含氮無機鹽、N2碳源：單糖、雙糖、多糖、醇類、有機酸等生長因子：維生素、氨基酸、X-因子、V－因子等的依賴性需氧性：好氧、微好氧、厭氧、兼性厭氧溫度：最低、最適及最高生長溫度及致死溫度對pH的適應(yīng)性：pH生長范圍對滲透壓的適應(yīng)性：對鹽溶度的耐受性或嗜堿性對抗生素及抑菌劑的敏感性：代謝產(chǎn)物：有機酸、氣體、酶類、色素、抗生素、毒素等與宿主的關(guān)系：共生、寄生、致病性等第42頁,共59頁，2024年2月25日，星期天形態(tài)和生理生化特征是最常用的細(xì)菌分類、鑒定指標(biāo)第43頁,共59頁，2024年2月25日，星期天腸道菌科細(xì)菌屬和種的分類鑒定第44頁,共59頁，2024年2月25日，星期天二、血清學(xué)試驗與噬菌體分型1.血清學(xué)試驗原理：抗原---抗體特異性結(jié)合凝集反應(yīng)、免疫熒光、ELISA快速、特異性強靈敏度高血清學(xué)分型在流行病的研究中有重要意義第45頁,共59頁，2024年2月25日，星期天2.噬菌體分型原理：一種噬菌體只裂解某種特定的細(xì)菌第46頁,共59頁，2024年2月25日，星期天四.核酸堿基組成和分子雜交1.DNA堿基組成DNA堿基因組成是各種生物一個穩(wěn)定的特征，即使個別基因突變，堿基組成也不會發(fā)生明顯變化。分類學(xué)上，用G+C占全部堿基的克分子百分?jǐn)?shù)(G+Cmol%)來表示各類生物的DNA堿基因組成特征。

(G+C)(mol)(G+C)％＝——————————×100％(A+T)十(G+C)(mol)第47頁,共59頁，2024年2月25日，星期天同種不同菌株G+Cmol%差異應(yīng)在4-5%以下。同屬不同種的G+Cmol%差異應(yīng)小于10-15%，通常小于10%原核微生物DNA(G+C)mol％為20—80。真核微生物DNA(G+C)mol％為30—60。

(G+C)％相同或相近的微生物并非必然親緣關(guān)系密切，也就是說，并非一定就是相同或相近的種屬。

(G+C)％值有明顯差異的微生物肯定不會屬于同一個種。

第48頁,共59頁，2024年2月25日，星期天G+C%的測定方法:

A、化學(xué)測定法B、熔解溫度(Tm)法

當(dāng)DNA在一定溫度下開始解鏈時，在260nm處吸收光譜明顯增加，達到一定的溫度后DNA全部解鏈，吸收光譜不再增加。

將25℃時DNA吸收光密度定為A25，測定不同解鏈溫度的光密度定為At，以At／A25為縱坐標(biāo)，加熱溫度為橫坐標(biāo)，作圖,即可得出一條S形曲線,曲線的中點即為Tm值。

先用酶水解DNA，用紙層析分離核苷酸堿基，然后洗脫和定量單個堿基。Marmur的經(jīng)驗公式:(G+C)%=(Tm―69.3)×2.44

第49頁,共59頁，2024年2月25日，星期天◆每個生物種都有特定的GC%范圍，因此后者可以作為分類鑒定的指標(biāo)。細(xì)菌的GC%范圍為25--75%，變化范圍最大，因此更適合于細(xì)菌的分類鑒定。第50頁,共59頁，2024年2月25日，星期天2、核酸雜交

生物的遺傳信息以堿基排列（遺傳密碼）形式，線性地排列在DNA