基因工程分子的雜交基因工程分子的雜交第1頁1968年由華盛頓卡內(nèi)基學院（CavnegieInstituteofWashington）RoyBritten及其同事創(chuàng)造。原理：帶有互補特定核苷酸序列單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其對應同源區(qū)段將會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。

1核酸分子雜交技術(shù)基因工程分子的雜交第2頁彼此退火核酸來自不一樣生物有機體，而形成雙鏈分子。DNA/DNA雜交作用：檢測特定生物有機體之間親源關系DNA/DNA或RNA/DNA能力，揭示核酸片斷中某種特定基因位置。1.1雜種核酸分子基因工程分子的雜交第3頁按其分子種類劃分

1）DNA雜交—探針為DNA或RNA

2）RNA雜交—探針為DNA或cDNA1.2核酸雜交類型基因工程分子的雜交第4頁3）蛋白質(zhì)免疫分析—探針為抗體基因工程分子的雜交第5頁按樣品制備過程劃分

1）原位雜交(insituhybridization)

i.原位菌落雜交

ii.原位噬菌斑雜交

iii.原位細胞雜交

iv.原位組織塊雜交1.2核酸雜交類型基因工程分子的雜交第6頁起源于標準光學顯微鏡技術(shù)，這種技術(shù)曾被用來觀察細胞分裂期染色體形態(tài)。對于許多生物體來說，能夠經(jīng)過染色體形狀或者不一樣方法染色來區(qū)分。原位雜交提供了一個經(jīng)過在光學顯微鏡下觀察染色體圖像，直接定位克隆基因方法。

原位雜交基因工程分子的雜交第7頁原位雜交優(yōu)點不但能夠判定出基因存在于哪條染色體上，還能夠提供染色體上基因位置相關信息。

基因工程分子的雜交第8頁特點：原位裂解細胞，不需要分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)樣品，可同時處理大量樣品，常見于目標基因篩選或檢測某類細胞或組織中是否存在某一特定DNA、RNA或蛋白質(zhì)序列?；蚬こ谭肿拥碾s交第9頁比如：菌落雜交原位雜交之一，是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使溶菌DNA同濾膜原位結(jié)合，帶有DNA濾膜烘干后，與放射性同位素標識特異DNA或RNA探針雜交。目標：判定重組子?；蚬こ谭肿拥碾s交第10頁檢測重組體克隆菌落雜交技術(shù)基因工程分子的雜交第11頁經(jīng)固定劑處理細胞被黏附在載玻片上，然后用核糖核酸酶和氫氧化鈉降解RNA，并使DNA分子變性，單個多聚核苷酸鏈之間配對堿基被拆散，而且染色體也在一定程度上被拆開，暴露出通常被包裹在它們結(jié)構(gòu)之中DNA片段。將一定量被標識基因摻入到制備好染色體中。標識基因和它染色體拷貝雜交，最終在放射性自顯影中形成一個黑點。這個黑點位置表示標識基因在染色體上位置。盡管技術(shù)較難，但大家已經(jīng)利用原位雜交和放射性標識探針，定位人類細胞遺傳圖譜上相當數(shù)量基因。原位細胞雜交基因工程分子的雜交第12頁基因工程分子的雜交第13頁大家用熒光標識物替換放射性標識，將它連接到雜交探針上，探針與DNA分子雜交后，能夠經(jīng)過熒光顯微鏡直接觀察試驗結(jié)果。假如使用不一樣熒光染料，能夠同時探測兩個或更多基因，經(jīng)過熒光顏色間顯著差異能夠分辨出不一樣雜交信號。FISH經(jīng)常與已知正常染色體位置探針一起使用，這項技術(shù)對于研究染色體已經(jīng)重新排列細胞尤其有用。染色體重新排列，比如染色體復制，或者是某一DNA片段從一條染色體轉(zhuǎn)移到另一條染色體上，都能夠經(jīng)過FISH相對較快地測定出來，比傳統(tǒng)染色技術(shù)快很多。熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)基因工程分子的雜交第14頁2）斑點雜交(dothybridization)

先分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)，然后將樣品液直接點在固體基質(zhì)上進行雜交，不能測定分子量大小?；蚬こ谭肿拥碾s交第15頁先純化樣品，然后使不一樣大小分子在凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到固體基質(zhì)上，與探針雜交。該法可檢測出感興趣分子分子量。用于轉(zhuǎn)移方法有：

i.擴散法

ii.毛細管法

iii.電泳轉(zhuǎn)移法

iv.真空轉(zhuǎn)移法

3）轉(zhuǎn)移雜交或印跡雜交(blottinghybridization)基因工程分子的雜交第16頁它利用兩種探針與待測DNA結(jié)合，先將不帶標識探針固定在基質(zhì)上，然后用待測樣品與之雜交，洗去非特異性結(jié)合后，再與第二種帶標識探針雜交。這種方法可用于粗制DNA樣品，可檢測出0.2ngDNA樣品4)夾心雜交法(sandwichhybridization)基因工程分子的雜交第17頁

1)DNA和RNA雜交制備DNA或RNA樣品→與固定基質(zhì)結(jié)合→80℃真空固定→預雜交→加入標識探針雜交→洗滌→放射自顯影或顯色反應。

2）蛋白質(zhì)免疫分析制備蛋白質(zhì)樣品→與固定基質(zhì)結(jié)合→常溫空氣中固定→封閉劑封閉→一抗反應→洗滌→二抗-酶偶聯(lián)物反應→洗滌→顯色反應（EIA）或→一抗放射標識物→洗滌→放射自顯影（RIA）2分子雜交普通程序基因工程分子的雜交第18頁2.1雜交樣品膜制備1.固定基質(zhì)種類與特征

1）硝酸纖維素濾膜(Nitrocellulosefilter,NCF)可與三類大分子結(jié)合，其機理不清楚，可能為被動吸附。NCF不能結(jié)合小分子DNA，RNA和蛋白質(zhì)（<20,000）基因工程分子的雜交第19頁優(yōu)點：i.用于DNA，RNA雜交分析時結(jié)果可靠，靈敏，本底低。ii.用于蛋白質(zhì)分析時，容量大（80μg/cm2)；可直接染色；分辨率高；不需要預激活；易于操作缺點：

結(jié)合低分子蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，重復使用探針次數(shù)有限（2-3次）硝酸纖維素濾膜NCF基因工程分子的雜交第20頁硝酸纖維素膜

不能滯留小于150bpDNA片斷，不能同RNA結(jié)合。

應用1mol/L醋酸銨和0.2mol/LNaOH緩沖液代替SSC緩沖液可改進對小片斷DNA滯留能力。

RNA變性后也能十分輕易結(jié)合到膜上。基因工程分子的雜交第21頁2）重氮化紙：DBM紙與DPT纖維素紙最大特點：能結(jié)合小分子DNA，RNA和蛋白質(zhì)，共價結(jié)合，可用不一樣探針進行屢次雜交分析。該類基質(zhì)結(jié)合生物大分子能力差，需要激活，分析蛋白質(zhì)時最好用放射性標識物。這類基質(zhì)對生物大分子是主動吸附?；蚬こ谭肿拥碾s交第22頁i.陽離子尼龍膜（如Zeta-prob，Zeta-bind等）

i)容量大,蛋白質(zhì)可結(jié)合480μg/cm2ii)可結(jié)合不一樣大小DNA(6n.t.)，RNA和蛋白質(zhì)。

iii)韌性好

iv)可用于電轉(zhuǎn)移

v)可進行重復屢次雜交試驗

vi)廣泛化學耐受性和可高溫消毒*不能用于蛋白質(zhì)直接染色

ii.尼龍66

廣泛用于核酸印跡分析，靜電荷可從pH4時陽離子狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閜H7時陰離子狀態(tài)。

3)尼龍膜基因工程分子的雜交第23頁4）離子膜i.DEAE-纖維素紙(可用于ss-DNA,ds-DNA,RNA制備回收)ii.CM-纖維素紙(可用于堿性蛋白質(zhì)結(jié)合)基因工程分子的雜交第24頁固定基質(zhì)選擇依據(jù)1）強度，耐久性，操作簡便2）高信噪比（低本底高信號）3）生物大分子結(jié)合容量和穩(wěn)定性4）重現(xiàn)性好基因工程分子的雜交第25頁核酸雜交常見幾個膜性能比較基因工程分子的雜交第26頁

尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交步驟：

1.核酸印跡轉(zhuǎn)移：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持膜上。利用是毛細管作用

2.印跡雜交：將含有核酸印跡濾膜同帶有標識DNA/RNA進行雜交。基因工程分子的雜交第27頁1）原位雜交樣品膜制備2.2各種雜交樣品膜制備基因工程分子的雜交第28頁

2）斑點雜交樣品膜制備制備樣品→點樣→固定（可用斑點雜交儀或直接點樣）基因工程分子的雜交第29頁3）轉(zhuǎn)移雜交樣品膜制備

i.擴散法（Difusionblottingmethod)基因工程分子的雜交第30頁ii.毛細管法(Capillaryblottingmethod)

Southern印跡基因工程分子的雜交第31頁iii.電轉(zhuǎn)移法(electroblotting)基因工程分子的雜交第32頁iv.真空轉(zhuǎn)移法(Vaccumbllotting)

轉(zhuǎn)移速度與凝膠速度和厚度成反比，在相同轉(zhuǎn)移率（50%）時，真空法比毛細管法快13倍，其損失僅6%，而毛細管法損失率20%。

v.各種轉(zhuǎn)移方法比較

i)擴散法和毛細管法：操作簡便，不需要特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低,（擴散法為70%，毛細管法80%）耗時多。

ii)電轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對轉(zhuǎn)移條件要求較嚴。

iii)真空轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀?；蚬こ谭肿拥碾s交第33頁i)固定基質(zhì)選擇

ii)轉(zhuǎn)移前預處理：DNA和RNA分子變性，蛋白質(zhì)則需除去凝膠中SDS。

iii)大分子轉(zhuǎn)移對于分子量較大DNA片段，必須進行原位斷裂后再進行轉(zhuǎn)移，斷裂DNA分子最正確長度為1-2kb。vi.轉(zhuǎn)移最正確條件

其步驟是：0.25MHCl處理凝膠兩次（每次15分鐘）→水洗→0.5MNaOH/1MNaCl兩次，每次15分鐘→轉(zhuǎn)移。對于大分子蛋白質(zhì)，可采取下述三種方法之一：解偶聯(lián)劑使凝膠解聚；蛋白酶作用；轉(zhuǎn)移緩沖液中加入SDS?；蚬こ谭肿拥碾s交第34頁1.標識化合物種類

1）放射性同位素標識物125I，3H，14C用于蛋白質(zhì)標識；32P，3H，35S 用于核酸標識，其中32P和35S使用頻率高。32P標識核苷酸α位或γ位，35S則是標識核苷酸α位.2.3標識探針制備基因工程分子的雜交第35頁2)非放射性標識物

i.生物素分離自蛋黃水溶性維生素，它能夠和分離自蛋清中一個堿性蛋白—抗生物素蛋白牢靠地結(jié)合。每個抗生物素蛋白可結(jié)合4個生物素分子。另外，鏈霉菌抗生蛋白與生物素結(jié)合更牢靠，可大大提升其靈敏度。生物素能夠經(jīng)過化學法與不一樣化合物結(jié)合形成標識化合物。

基因工程分子的雜交第36頁ii.半抗原包含汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配體和金屬銪。地高辛配體是一個脂質(zhì)半抗原，可將其連在dUTP上，然后用酶將其摻入新合成鏈中。檢測上述標識物方法是利用二抗-酶偶聯(lián)物反應和顯色反應?；蚬こ谭肿拥碾s交第37頁iii.蛋白質(zhì)檢測標識物

i)酶偶聯(lián)二抗（0.05ng）

ii)蛋白質(zhì)A（來自金黃色葡萄球菌）?？勺饔糜诖蠖鄶?shù)哺乳動物IgG，靈敏度較低（5ng）

iii)免疫金（immunogold）0.1-0.5ng基因工程分子的雜交第38頁3)兩類標識化合物比較i.靈敏度檢測蛋白質(zhì)，兩種方法差不多。檢測核酸，放射法比酶法敏感。ii.穩(wěn)定性酶法探針可在4℃保留一年，放射性標識需每次制備。iii.安全性非放射性標識安全。iv.效率非放射性標識所需時間短?；蚬こ谭肿拥碾s交第39頁2.標識探針制備

1）鏈標識法

i.切口移位法

ds-DNA+DNaseI+DNApolI+dNTP(32P-dCTP)ii.隨機DNA引物延伸法

ds-DNA→ss-DNA-(6n,t)→Klenow片段+dNTP(32P)基因工程分子的雜交第40頁iii.反轉(zhuǎn)錄法

mRNA+dNTP(32P)→cDNA（標識）iv.轉(zhuǎn)錄法

含有待標識DNA片段重組質(zhì)粒+NTP(32P)→→RNA（標識）v.引物延伸法含待標識DNA單鏈DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32P)→待標識DNA鏈vi.T4DNA聚合酶法

ds-DNA→T4DNA聚合酶,無dNTP→3’-5’外切酶活性→加入dNTP和標識核苷酸→新合成鏈（32P）基因工程分子的雜交第41頁2)末端標識

i.5’-末端標識

ss-和ds-DNA,RNA→脫磷酸化反應(CIP)→T4DNA激酶(γ-32P)ATPii.3’-末端標識

i)TdT加尾反應，用于dsDNAii)補齊反應

iii)T4RNA連接酶反應RNA-OH+*pNp（3’-5’-二磷酸核苷）+ATP—RNA-*pNPp+pA+ppi

基因工程分子的雜交第42頁

3)標識化合物純化

i.柱層析利用SephadexG-50，前峰-標識物，后峰-核苷酸

ii.旋轉(zhuǎn)柱層析

快速，簡便,可同時純化多個樣品。

基因工程分子的雜交第43頁2.4分子雜交與結(jié)果檢測1.核酸雜交與結(jié)果檢測1）預雜交：預雜交液中常加入鮭魚精DNA，若標識探針是cDNA或RNA，預雜交液中還需加入多聚A以阻止特異性結(jié)合,42℃4-6h或過夜。2）雜交：探針100℃變性，快速冷卻，加入預雜交液中，42℃一天基因工程分子的雜交第44頁3）洗滌：2×SSC+0.1%SDS常溫洗滌兩次，1×SSC+0.1%SDS65℃洗滌兩次，每次15分鐘。若使用低聚核苷酸探針，洗滌溫度按下式計算：T=4GC+2AT*高強度與低強度雜交：若具高度特異性同源序列，采取高強度雜交條件；若使低同源性DNA之間雜交，則采取低強度雜交條件。這兩種條件之差異表現(xiàn)在雜交液和洗滌液離子強度以及雜交和洗滌時溫度?；蚬こ谭肿拥碾s交第45頁4）放射自顯影或顯色反應使用放射性同位素標識物，采取放射自顯影。若采取非放射性同位素標識物，則采取顯色反應。顯色反應將依據(jù)偶聯(lián)酶類而定。主要有兩種酶：

i.辣根過氧化物酶:

可將3，3’-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或?qū)?-氯萘酚氧化成紫色沉淀物?；蚬こ谭肿拥碾s交第46頁ii.堿性磷酸酶作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下，該化合物可轉(zhuǎn)變?yōu)樘m色沉淀物，該反應中釋放氫離子可將硝基蘭四唑還原成深紫色沉淀，這些沉淀物都是沉積在酶作用位點。

iii.兩種酶偶聯(lián)物比較

i)堿性磷酸酶靈敏度比辣根過氧化物酶高10倍左右，但噪聲大。

ii)堿性磷酸酶顯色反應可連續(xù)幾個小時，其顯色結(jié)果可長久保留，但辣根過氧化物酶顯色反應僅能連續(xù)30分鐘。

5)雜交結(jié)果基因工程分子的雜交第47頁2.蛋白質(zhì)免疫分析

封閉劑，明膠，牛血清蛋白，卵清蛋白等。

基因工程分子的雜交第48頁3SouthernDNA印跡雜交由E.Southern于1975年首先設計出來，依據(jù)毛細管作用原理，使在電泳凝膠中分離DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當濾膜上，然后經(jīng)過同標識單鏈DNA或RNA探針雜交作用，檢測這些被轉(zhuǎn)移DNA片段，這種試驗方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)?；蚬こ谭肿拥碾s交第49頁（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交基因DNA片段X光底片Southern凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)基因工程分子的雜交第50頁SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片

水稻（OryzasativaL.)葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料1%瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標識玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)陽性條帶，表明含有水稻psbA基因序列?；蚬こ谭肿拥碾s交第51頁

在進行核酸印跡轉(zhuǎn)移時，

1.要將已轉(zhuǎn)好硝酸纖維素膜在80度下烘烤1～2小時；

2.紫外線交聯(lián)法，將DNA分子上個別胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面帶正電荷氨基基團之間進行交聯(lián)。

基因工程分子的雜交第52頁4NorthernRNA印跡技術(shù)（Northernblotting）

1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其它化學修飾活性濾紙上，進行核酸雜交一個試驗方法。因為這種方法與SouthernDNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做NorthernRNA印跡技術(shù)（Northernblotting）。而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標識特定蛋白質(zhì)之抗體進行反應，這種技術(shù)叫做Western蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Westernblotting）?；蚬こ谭肿拥碾s交第53頁5凝膠阻滯試驗（Gelretardationassay）

又叫DNA遷移率變動試驗（DNAmobilityshiftassay）80年代早期出現(xiàn)用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用一個特殊凝膠電泳技術(shù)。它含有簡單、快捷等優(yōu)點，也是當前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)一個經(jīng)典試驗方法。原理：

DNA與蛋白結(jié)合造成了電泳時遷移率降低。基因工程分子的雜交第54頁凝膠阻滯試驗基礎原理圖放射性標識DNA因為同一個細胞蛋白質(zhì)B結(jié)合，于是在凝膠電泳中移動速度變慢，在放射自顯影中展現(xiàn)滯后條帶ACB放射自顯影****凝膠電泳放射性標識DNA細胞蛋白質(zhì)提取物蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合******BDNA-蛋白質(zhì)結(jié)合物電泳遷移遲緩滯后帶表明DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合基因工程分子的雜交第55頁不但能夠用來判定在特殊類型細胞提取物中，是否存在與某一特定DNA片斷結(jié)合蛋白質(zhì)分子而且能夠研究發(fā)生此中結(jié)合之準確DNA序列特異性。（加入超量非標識競爭DNA）基因工程分子的雜交第56頁(a)(b)(c)

在凝膠阻滯試驗中競爭DNA與探針DNA之間競爭作用（a）沒有加入競爭DNA正常凝膠阻滯試驗，探針DNA與特異蛋白質(zhì)結(jié)合，出現(xiàn)阻滯條帶；（b）加入超量競爭DNA與探針DNA競爭結(jié)協(xié)議一個蛋白質(zhì)，阻滯條帶消失；（c）競爭DNA與探針DNA分別結(jié)合不一樣蛋白質(zhì)，出現(xiàn)同（a）一樣阻滯條帶。**********蛋白質(zhì)與未標識競爭DNA結(jié)合凝膠電泳放射自顯影蛋白質(zhì)與標識探針DNA結(jié)合**********基因工程分子的雜交第57頁

能夠間接說明體內(nèi)發(fā)生DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用。

1.用含有已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點競爭DNA，可檢測蛋白是否屬于這類轉(zhuǎn)錄因子；

2.在競爭DNA已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點上，引入突變可評定突變對競爭DNA性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合影響?；蚬こ谭肿拥碾s交第58頁

凝膠阻滯試驗能揭示在體內(nèi)發(fā)生DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用相關信息，但無法確定二者結(jié)合準確部位，而DNaseⅠ足跡試驗能夠處理這個問題?；蚬こ谭肿拥碾s交第59頁6DNaseⅠ足跡試驗（footprintingassay）

是一類用于檢測與特定蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列部位及特征專門試驗技術(shù)。一個顯著優(yōu)點是，能夠形象地展示出一個特殊蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間結(jié)合區(qū)域?；蚬こ谭肿拥碾s交第60頁32p1510*14810*加入蛋白質(zhì)X加入DNaseI凝膠電泳放射自顯影1510AB足跡(a)(c)