第十單元生物技術(shù)與工程第36講

基因工程重組DNA技術(shù)的基本工具01基因工程的基本操作程序02DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(實(shí)驗(yàn))03基因工程的應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程04目錄考點(diǎn)一重組DNA技術(shù)的基本工具01[概念摘要]基因工程是一種重組DNA技術(shù)。指按照人們的愿望,通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作DNA重組技術(shù)。甲生物取出優(yōu)秀基因“剪切”

“拼接”

乙生物表達(dá)

新類型新的生物產(chǎn)品

1、基因工程的概念別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過程操作工具結(jié)果原理優(yōu)點(diǎn)基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品基因重組克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙、定向改造生物性狀分子運(yùn)輸車、分子手術(shù)刀、分子縫合針DNA分子水平1、基因工程的概念來源：主要從原核生物中分離純化來的作用：特點(diǎn)：特異性結(jié)果：形成黏性末端、平末端①識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列②使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開切割DNA分子的工具是限制性內(nèi)切核酸酶，簡(jiǎn)稱限制酶（又稱基因剪刀）。2、基因工程的基本工具（1）限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”作用：種類：①E.coliDNA連接酶②T4DNA連接酶連接互補(bǔ)配對(duì)的雙鏈DNA片段，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。類型E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能只能連接____________可連接_________和________________結(jié)果恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的____________從大腸桿菌中分離得到從T4噬菌體中分離得到黏性末端黏性末端平末端（效率低）磷酸二酯鍵使之成為一個(gè)完整的DNA分子。2、基因工程的基本工具（2）DNA連接酶——“分子縫合針”

將外源基因（目的基因）轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。作用：通常是用質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等可作載體。種類：病毒

它們的來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有差別。2、基因工程的基本工具（3）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”運(yùn)載體需具備的條件（同時(shí)具備）①在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并能自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制；②具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源基因（目的基因）插入其中；③具有特殊的標(biāo)記基因，便于篩選含有重組DNA分子的細(xì)胞；④對(duì)受體細(xì)胞無害、易分離。2、基因工程的基本工具（3）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”【概念辨析】1．切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列。()2．限制酶只能用于切割目的基因。()3．限制酶也可以識(shí)別和切割RNA。()4．DNA連接酶能將兩堿基通過氫鍵連接起來。()5．載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選的標(biāo)記基因。()×××××1、基因工程的理論基礎(chǔ)2、限制酶的選擇方法根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)、質(zhì)粒上的限制酶切割位點(diǎn)以及是否破壞目的基因和標(biāo)記基因來確定限制酶的種類。（1）應(yīng)選擇酶切位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ；不能選擇酶切位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。2、限制酶的選擇方法（2）為避免目的基因及質(zhì)粒的自身環(huán)化、反向連接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和質(zhì)粒(雙酶切)，如圖甲可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點(diǎn))。（3）切割質(zhì)粒的限制酶不能同時(shí)切開質(zhì)粒上的所有標(biāo)記基因，即至少要保留一個(gè)標(biāo)記基因，以用于重組DNA的鑒定和選擇，如圖乙中的質(zhì)粒不能使用SmaⅠ切割。項(xiàng)目作用部位作用對(duì)象作用結(jié)果連接酶限制酶聚合酶解旋酶水解酶磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵氫鍵DNA片段DNA單個(gè)的脫氧核苷酸DNADNA將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸將兩個(gè)DNA片段連接成完整DNA分子切割雙鏈DNA分子將單個(gè)脫氧核苷酸連到DNA單鏈末端將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈3、與DNA有關(guān)的幾種酶的比較考法1結(jié)合基因工程工具酶，考查科學(xué)思維能力1．(2022·青島期中)下表為常用的限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)及其識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，由此推斷以下說法中，錯(cuò)誤的是(

)DA．HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端B．Sau3AⅠ限制酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列的外部C．BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端D．一種限制酶一定只能識(shí)別一種核苷酸序列回答下列問題：（1）常用的DNA鏈接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。如圖中________________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。如圖中________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接?？挤?結(jié)合基因工程工具酶，考查科學(xué)思維能力2．(2021·全國乙卷)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)如圖所示。EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅤ回答下列問題：（2）DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是_________________。考法1結(jié)合基因工程工具酶，考查科學(xué)思維能力2．(2021·全國乙卷)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)如圖所示。磷酸二酯鍵回答下列問題：（3）DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能____________________；考法1結(jié)合基因工程工具酶，考查科學(xué)思維能力2．(2021·全國乙卷)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)如圖所示。自我復(fù)制、穩(wěn)定存在回答下列問題：（3）質(zhì)粒DNA分子上有___________________________________便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)。利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是____________________________________________________________________________。考法1結(jié)合基因工程工具酶，考查科學(xué)思維能力2．(2021·全國乙卷)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)如圖所示。一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)用含該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞回答下列問題：（4）表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指______________________________________________________________________________?？挤?結(jié)合基因工程工具酶，考查科學(xué)思維能力2．(2021·全國乙卷)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)如圖所示。轉(zhuǎn)錄開始的地方，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)A．①②③共同組成核糖核苷酸B．質(zhì)粒中的堿基遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則C．DNA連接酶會(huì)使化學(xué)鍵④重新連接D．若某種限制酶在質(zhì)粒上只有一個(gè)酶切位點(diǎn)，則質(zhì)粒被切為兩個(gè)片段考法2結(jié)合載體的作用及特點(diǎn)，考查科學(xué)思維的能力3．(2022·房山區(qū)二模)大腸桿菌的質(zhì)?！h(huán)狀DNA是基因工程的常用載體，結(jié)構(gòu)如圖。下列敘述正確的是(

)B考法2結(jié)合載體的作用及特點(diǎn)，考查科學(xué)思維的能力4．圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因(TetR)和氨芐青霉素抗性基因(AmpR)。請(qǐng)回答下列問題：（1）EcoRⅤ酶切位點(diǎn)為

，EcoRⅤ酶切出來的線性載體P1為______末端。平考法2結(jié)合載體的作用及特點(diǎn)，考查科學(xué)思維的能力4．圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因(TetR)和氨芐青霉素抗性基因(AmpR)。請(qǐng)回答下列問題：（2）用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個(gè)堿基為_________脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重組質(zhì)粒P3。胸腺嘧啶DNA連接（3）為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長(zhǎng)情況如下表(“＋”代表生長(zhǎng)，“－”代表不生長(zhǎng))。根據(jù)表中結(jié)果判斷，應(yīng)選擇的菌落是____(填表中字母)類，另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是________________、________________________?？挤?結(jié)合載體的作用及特點(diǎn)，考查科學(xué)思維的能力4．圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因(TetR)和氨芐青霉素抗性基因(AmpR)。請(qǐng)回答下列問題：BA類菌落含有P0C類菌落未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒（4）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是________。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物，結(jié)果從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段，原因是__________________________________________。乙、丙目的基因反向連接1、關(guān)于基因工程中載體的敘述，錯(cuò)誤的是()A．載體與目的基因結(jié)合的過程發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)B．載體須具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接C．基因工程常用的載體有質(zhì)粒、λ噬菌體和動(dòng)植物病毒等D．載體須具有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇A作業(yè)2、下列有關(guān)基因工程的敘述，正確的是()A．基因工程是細(xì)胞水平上的生物工程B．基因工程的產(chǎn)物對(duì)人類都是有益的C．基因工程育種的優(yōu)點(diǎn)之一是目的性強(qiáng)D．基因工程產(chǎn)生的變異屬于人工誘變C3、下列關(guān)于限制性內(nèi)切核酸酶的敘述錯(cuò)誤的是（）A．絕大多數(shù)的限制酶由原核細(xì)胞中獲取 B．每一種限制性內(nèi)切核酸酶只能識(shí)別特定的核苷酸序列 C．限制酶的作用位點(diǎn)是相鄰核苷酸之間的氫鍵 D．同一種限制酶切割不同的DNA分子可產(chǎn)生堿基互補(bǔ)配對(duì)的粘性末端C作業(yè)4、下面哪項(xiàng)不具有限制酶識(shí)別序列的特征（）A．GAATTCB．GGGGCCCCCTTAAGCCCCGGGGC．CTGCAGD．CTAAATCGACGTCGATTTAGD5、限制酶