實驗目的

1、進行菊花的組織培養(yǎng)2、嘗試植物激素的應用第2頁,共25頁，2024年2月25日，星期天通過必修課的學習，我們已經(jīng)了解到大多綠色開花植物都是靠種子來繁殖的。那么，有沒有不用種子來培育植物的方法呢？組織培養(yǎng)營養(yǎng)繁殖扦插嫁接壓條

無性繁殖一、基礎知識分析

（一）組織培養(yǎng)的生殖方式第3頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（二）植物組織培養(yǎng)的基本過程知識要點:1.細胞分化的概念；2.離體植物細胞的脫分化和再分化。第4頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（三）影響植物組織培養(yǎng)的因素影響植物組織培養(yǎng)的因素有培養(yǎng)基配制、外植體的選取、消毒、接種、培養(yǎng)、移栽和栽培等。(1)外植體選取不同的植物組織

同一植物的不同材料(2)營養(yǎng)(3)環(huán)境條件(pH、溫度、光照)(4)植物激素(5)消毒第5頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（四）生長素與細胞分裂素使用配比對實驗結(jié)果的影響使用配比實驗結(jié)果細胞分裂素>生長素濃度誘導芽的生成細胞分裂素=生長素濃度愈傷組織繼續(xù)生長而不分化細胞分裂素<生長素濃度誘導根的生成第6頁,共25頁，2024年2月25日，星期天制備MS固體培養(yǎng)基外植體消毒接種培養(yǎng)栽培移栽二、實驗操作

第7頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（一）制備MS固體培養(yǎng)基1、配制母液

按照MS培養(yǎng)基成分表,配制分別配制培養(yǎng)基的母液。

(1)大量元素母液(10倍液)

分別稱取10倍用量的各種大量無機鹽，依次溶解于大約800ml熱的（60-80℃）蒸餾水中。（一種成分完全溶解后再加入下一種，最后加水，定容至1000ml后裝入試劑瓶中，冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆茫?2)微量元素母液(100倍液)(3)鐵鹽母液（100倍液）(4)有機物質(zhì)母液(100倍數(shù))(5)生長素母液(6)細胞分裂素母液注意:配制培養(yǎng)基時，一定要注意調(diào)節(jié)pH。第8頁,共25頁，2024年2月25日，星期天MS培養(yǎng)基配制方法返回第9頁,共25頁，2024年2月25日，星期天你能說出各種營養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？問題思考微量元素和大量元素提供植物細胞生活所必需的無機鹽；蔗糖提供碳源，同時能夠維持細胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營養(yǎng)需求。微生物培養(yǎng)基以有機營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機營養(yǎng)，無機鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。第10頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

(1)取1000ml燒杯一只，加大量元素10倍母液100ml，微量元素100倍母液10ml，鐵鹽100倍母液10ml,有機物質(zhì)100倍母液10ml。此外,根據(jù)培養(yǎng)材料和實驗目的還要附加一定量的生長素,細胞分裂素及蔗糖等,然后加水至1000ml,待蔗糖充分溶解后用1mol/L的NaOH或HCl調(diào)酸堿度為pH5.8,最后加入瓊脂粉6.5g,如用瓊脂條,則要加8g。2.培養(yǎng)基配制配制與分裝：

(2)將盛有培養(yǎng)基的燒杯在電磁爐上，煮至瓊脂完全融化，補加蒸餾水至1000ml。將配制好的培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)用三角瓶中，每只100ml三角瓶約裝40ml培養(yǎng)基。分裝時要避免把培養(yǎng)基倒在瓶口上，否則培養(yǎng)時容易引起雜菌污染。

第11頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

（1）把裝好的培養(yǎng)基的三角瓶放入高壓滅菌鍋中，蓋好鍋蓋。

（2）設置滅菌溫度參數(shù)為121℃，20min，開始滅菌。

3、滅菌無菌技術是植物組織培養(yǎng)能否獲得成功的關鍵．

第12頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（二）外植體（離體組織）消毒

注意：對培養(yǎng)材料進行表面滅菌時，一方面要考慮藥劑的消毒效果；另一方面還要考慮植物材料的耐受能力。不同藥劑、不同植物材料，甚至不同器官要區(qū)別對待。

1、70﹪酒精中浸泡10min，無菌水沖洗2、5%次氯酸鈉溶液中浸泡，無菌水沖洗3、用另一5%次氯酸鈉溶液浸泡5min，無菌水沖洗4、超凈臺中用無菌水多次沖洗第13頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（三）切段后接種

1、先用肥皂洗手，穿上工作服，戴上口罩和工作帽。2、放入培養(yǎng)瓶和滅菌后的接種用具(鑷子、解剖刀、接種針)，把鑷子、解剖刀、接種針插入內(nèi)盛70%酒精的廣口瓶中。第14頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

3、在酒精燈火焰旁，打開三角瓶，把花莖用無菌解剖刀切成幾段，每段至少有一張葉片

4、切段插入培養(yǎng)基，誘導愈傷組織，蓋上封口膜。

5、愈傷組織插入生芽培養(yǎng)基，蓋上封口膜。6、用記號筆在瓶壁上寫明培養(yǎng)材料、培養(yǎng)基代號、接種日期。注意事項全部接種操作都是在無菌條件下進行的，所以要特別認真仔細，以防雜菌污染。第15頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（四）培養(yǎng)接種后的錐形瓶最好放在無菌箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間應定期消毒，溫度控制在１８～２5℃，并且每日照光１4.5小時。觀察記錄生長情況，并照相存檔。2~3周后將生長健壯的叢狀苗在無菌條件下一個個轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)第16頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（五）移栽（六）栽培生根后，將苗移至消毒的草炭土或蛭石中，用玻璃罩或塑料布保持80%以上濕度，2~3天后打開玻璃罩低濕度鍛煉轉(zhuǎn)移至土中培養(yǎng)（定植）第17頁,共25頁，2024年2月25日，星期天三、結(jié)果分析與評價

（一）對接種操作中污染情況的分析

接種3～4d后，在接種操作中被雜菌污染的培養(yǎng)物會表現(xiàn)出被污染的現(xiàn)象。請學生適時統(tǒng)計污染率，分析接種操作是否符合無菌要求。第18頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（二）是否完成了對植物組織的脫分化和再分化觀察實驗結(jié)果，看看是否培養(yǎng)出了愈傷組織，記錄多長時間長出愈傷組織。統(tǒng)計更換培養(yǎng)基后愈傷組織進一步分化成根和芽的比例和時間。（三）是否進行了統(tǒng)計、對照與記錄做好統(tǒng)計和對照，填好結(jié)果記錄表，培養(yǎng)嚴謹?shù)目茖W態(tài)度。從實驗的第一步開始就要求做好實驗記錄，實驗小組配制不同培養(yǎng)基，如誘導愈傷或直接分化叢芽的培養(yǎng)基，然后做不同配方的比較。第19頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（四）生根苗的移栽是否合格生根苗移栽技術的關鍵是既要充分清洗根系表面的培養(yǎng)基，又不能傷及根系。一般使用無土栽培的辦法。培養(yǎng)基質(zhì)要提前消毒，可以向培養(yǎng)基質(zhì)噴灑質(zhì)量分數(shù)為5%的高錳酸鉀，并用塑料薄膜覆蓋12h。掀開塑料薄膜后24h才能移栽。新移栽的組培苗要在溫室過渡幾天，等壯苗后再定植大田或進行盆栽。學生可以在課后統(tǒng)計自己移栽的成活率，看看移栽是否合格。第20頁,共25頁，2024年2月25日，星期天四、本課題知識小結(jié)

菊花的組織培養(yǎng)原理：細胞的全能性條件基礎概念植物組織培養(yǎng)的基本過程：環(huán)境因素（溫度、PH、光照）外植體的選擇營養(yǎng)因素植株根、芽愈傷組織外植體影響植物組織培養(yǎng)的因素植物激素配比實驗過程：移栽栽培培養(yǎng)接種外植體消毒制備MS培養(yǎng)基第21頁,共25頁，2024年2月25日，星期天五、練習

植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，對培養(yǎng)條件的要求較高。用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合于某些微生物的生長，如一些細菌、真菌等的生長。而培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會導致實驗前功盡棄，因此要進行嚴格的無菌操作。

外植體的生理狀態(tài)是成功進行組織培養(yǎng)的重要條件之一。生長旺盛的嫩枝生理狀況好，容易誘導脫分化和再分化。１．在植物組織培養(yǎng)過程中，為什么要進行一系列的消毒，滅菌，并且要求無菌操作？２．在選取菊花莖段的時候，為什么要選取生長旺盛的嫩枝？第22頁,共25頁，2024年2月25日，星期天3、不同植物、不同組織的生根和生芽是否都可以使用與本實驗相同的生長素和細胞分裂素濃度4、本實驗用人工合成的激素，而不用植物中存在的天然激素，為什么？5、如果在自然界取植物樣本進行組織培養(yǎng)，你認為應采取什么措施保證樣本不被污染？任何植物物種或品種都不可貿(mào)然使用與本實驗相同的生長素和細胞分裂素濃度，必須要套索使用如何合成激素和何種激素濃度才可以。學習者可以參考已有文獻上成熟的經(jīng)驗，也可以自己探索植物中存在的天然激素有相應的使之分解的酶，這樣，天然激素在植物體內(nèi)作用和存在的時間就較短，而人工合成的激素在植物中沒有相應使之分解的酶，所以作用和存在時間長，作用效果也更明顯。（1）操作環(huán)境潔凈（2）植物樣本潔凈（3）操作過程無菌因為污染物的來源是操作過程中和植物本身帶來的，主要是微生物的污染，要采用各種措施防止微生物污染，具體做法和操作在微生物培養(yǎng)實驗中已經(jīng)介紹。除認真消毒除菌外，操作敏捷迅速，也可以降低污染率第23頁,共25頁，2024年2月25日，星期天6．右圖為植物體細胞雜交過程示意圖。據(jù)圖回答：

（1）步驟①是

，最常用的方法是

。

（2）步驟③一般常用的化學試劑是

，目的是

。

(3)在利用雜種細胞培育成為雜種植株的過程中，運用的技術手段是

，其中步驟④相當于

，步驟⑤相當于