ICS65.020.20

CCSB22

DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T4139—2021

小麥赤霉病菌抗藥性監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程

TechnicalregulationformonitoringoffungicideresistanceinFusariumspp.causing

wheatheadblight

2021-11-04發(fā)布2021-12-04實(shí)施

江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T4139-2021

I

DB32/T4139-2021

小麥赤霉病菌抗藥性監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了小麥赤霉病菌抗藥性監(jiān)測(cè)對(duì)象、敏感性基線確定、采樣與分離、敏感性測(cè)定等技術(shù)要

求。

本文件適用于小麥赤霉病菌對(duì)常用殺菌劑抗性監(jiān)測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

NY/T1156.1—2006農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺菌劑第1部分：抑制病原真菌孢子萌發(fā)試驗(yàn)凹

玻片法

NY/T1156.2—2006農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺菌劑第2部分：抑制病原真菌菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn)平

皿法

NY/T1859.1農(nóng)藥抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估第1部分：總則

NY/T1859.6農(nóng)藥抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估第6部分：灰霉病菌抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

3術(shù)語(yǔ)和定義

NY/T1859.1和NY/T1859.6界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

區(qū)分劑量criticalconcentration

能夠鑒別抗藥性菌株和敏感菌株的藥劑濃度。

4監(jiān)測(cè)對(duì)象

監(jiān)測(cè)對(duì)象包括：

a)苯并咪唑類殺菌劑：多菌靈、甲基硫菌靈

b)麥角甾醇生物合成抑制劑：戊唑醇、丙硫菌唑、葉菌唑、丙環(huán)唑、三唑酮、咪鮮胺、己唑醇、

氟環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑

c)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑：嘧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌酯、烯肟菌酯、肟菌酯

d)琥珀酸脫氫酶抑制劑：氟唑菌酰羥胺、萎銹靈

e)肌球蛋白抑制劑：氰烯菌酯

f)多作用位點(diǎn)殺菌劑：福美雙、百菌清

1

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5敏感性基線確定

按照NY/1859.6執(zhí)行。

6采樣與分離

6.1采樣

小麥?zhǔn)斋@前在多個(gè)代表性監(jiān)測(cè)點(diǎn)采集赤霉病發(fā)病的麥穗，或在小麥抽穗前20至25天采集含病殘?bào)w

的稻樁。采集的每個(gè)樣本分別裝入1個(gè)紙質(zhì)信封，并記錄采樣人及聯(lián)系方式、采樣的小麥品種、用藥情

況及地點(diǎn)（省、市縣、鄉(xiāng)鎮(zhèn)、村、組、農(nóng)戶）。做好記錄并將樣品晾干防止霉變。

6.2分離

挑取稻樁上的病殘?bào)w或麥穗上的病麥粒，放在含有50μg/mL五氯硝基苯和100μg/mL硫酸鏈霉素

的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA，PotatoDextroseAgar）平板上，分離小麥赤霉病菌。

7敏感性測(cè)定

7.1藥劑配制

將有效含量90%以上的殺菌劑原藥溶解在合適的溶劑中，制成10mg/mL的母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

7.2測(cè)定方法

7.2.1菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定法

本方法適用于監(jiān)測(cè)對(duì)所有登記藥劑的抗藥性。將分離的小麥赤霉病菌接種至含區(qū)分劑量藥劑培養(yǎng)基

上，25℃黑暗培養(yǎng)3天，觀察菌株生長(zhǎng)情況，能生長(zhǎng)的即為抗性菌株，不生長(zhǎng)的即為敏感菌株。具體步

驟按照NY/T1156.2—2006。

7.2.2孢子萌發(fā)測(cè)定法

本方法適用于監(jiān)測(cè)對(duì)甲氧基丙烯酸酯類和琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑的抗藥性。制備各菌株的分

生孢子或子囊孢子，用無(wú)菌水稀釋至約104-5個(gè)/mL孢子液，吸取100μL孢子液均勻涂布在含有不同藥

劑濃度的水瓊脂平板上，在25oC下黑暗培養(yǎng)6至8小時(shí)（對(duì)照萌發(fā)95%時(shí)），顯微鏡下檢查孢子的萌

發(fā)率（芽管長(zhǎng)度達(dá)孢子寬度的1/2即為萌發(fā)），計(jì)算各菌株的EC50值和抗藥性指數(shù)。具體步驟按照NY/T

1156.1—2006。

7.2.3LAMP高通量測(cè)定法

本方法適用于監(jiān)測(cè)因小麥赤霉病菌β2-Tubulin的F167Y基因型突變引起的多菌靈抗性。根據(jù)LAMP

擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色可判定菌株是否為多菌靈抗性，具體技術(shù)方法按照附錄A執(zhí)行。

8抗藥性評(píng)價(jià)

8.1抗藥性頻率及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

抗藥性頻率（%）=抗藥性菌株數(shù)/測(cè)定菌株數(shù)100。抗藥性頻率5%以下，為低等風(fēng)險(xiǎn)；抗藥性頻

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率為5%～10%為中等風(fēng)險(xiǎn)；抗藥性頻率10%以上為高等風(fēng)險(xiǎn)。

8.2影響抗藥性風(fēng)險(xiǎn)的其他因素

8.2.1抗藥性指數(shù)

抗藥性指數(shù)5～20，為低等抗性水平；抗藥性指數(shù)為20～100為中等抗性水平；抗藥性指數(shù)大于100

為高等抗性水平?？顾幮匀后w的抗藥性指數(shù)越大，抗性風(fēng)險(xiǎn)越大。

8.2.2交互抗性模式

當(dāng)測(cè)定到抗性菌株時(shí)，則進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)其他殺菌劑的交互抗性。具體按照NY/1859.6執(zhí)行。若與

其他藥劑有交互抗性，則一定程度上加大了抗性風(fēng)險(xiǎn)。

8.2.3田間種植方式

單一種植同一小麥品種，有利于抗藥性群體的發(fā)展。

8.2.4田間氣候條件

合適的溫度、濕度有利于小麥赤霉病菌的生長(zhǎng)、繁殖和侵染，同時(shí)也有利于抗藥性群體的發(fā)展。

9結(jié)果應(yīng)用

由省農(nóng)業(yè)主管部門發(fā)布小麥赤霉病菌抗藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果，指導(dǎo)全省小麥赤霉病化學(xué)防控科學(xué)用藥。

10抗性菌株及廢棄樣本的處理

10.1將抗性菌株4℃保存于含有PDA培養(yǎng)基的凍存管中，以備復(fù)測(cè)。

10.2將分離后的樣本燒毀或高溫滅菌處理，防止抗藥性菌株在檢測(cè)地點(diǎn)擴(kuò)散。

3

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附錄A

（規(guī)范性）

LAMP高通量檢測(cè)小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈抗藥性

（β2-Tubulin第167位氨基酸突變（F167Y））

A.1DNA模板制備

用試劑盒將分離的小麥赤霉病菌菌絲體或?qū)⒑胁≡男←湶×?、或稻樁的子囊殼加入含有CTAB

提取液的離心管中，用組織研磨機(jī)震蕩30s（28次/s），在12000rpm離心3min，吸取上清加入冰凍

異丙醇沉淀DNA；12000rpm離心3min，棄上清；用70%的乙醇漂洗1次，12000rpm離心3min，棄上

清，風(fēng)干后加無(wú)菌水溶解基因組DNA，備用。

A.2檢測(cè)引物

F3:TTCCAGCTGACGCACTCT

B3:ACAGAAGGTCTCGTCAGAGT

FIP:TGCGATCGGGGAACTCCTCG-TGGTACCGGTTCCGGTATG

BIP:AAACCGTTATGCCCTCGCCC-ACGAGCTGGTTCAGAGACAA

A.3反應(yīng)體系與條件（10μL）

BstDNA聚合酶（8U/μL）0.3μL；10×ThermoPol1.0μL；MgCl2（25mM）1.6μL；dNTP（10mM）

1.0μL；FIP（40μM）0.4μL；BIP（40μM）0.4μL；F3（10μM）0.2μL；B3（10μM）0.2μL；甜

菜堿（8M）1.2μL；HNB（2.5mM）0.6μL；基因組DNA0.5μL；dH2O（滅菌蒸餾水）2.6μL。反

應(yīng)參數(shù)：63℃60min，80℃10min。

按照上述反應(yīng)體系在恒溫水浴鍋中63℃反應(yīng)60min，80℃10min終止反應(yīng)，對(duì)上述LAMP擴(kuò)增產(chǎn)

物觀察其顏色變化，鑒定是否