ICS65.020.20

B31

DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3775—2020

豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-LAMP檢測(cè)

方法

RT-LAMPmethodforDetectiongPorcineReproductiveandRespiratory

SyndromeVirus

2020-04-08發(fā)布2020-05-15實(shí)施

江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3775—2020

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：姜平、張日騰、白娟、熊富強(qiáng)、王先煒、李玉峰、陳聞。

II

DB32/T3775—2020

豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-LAMP檢測(cè)方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-LAMP檢測(cè)原理、試劑和儀器設(shè)備、檢測(cè)程序和結(jié)果判

定。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬臨床樣品（肺臟、脾臟和血清）和細(xì)胞培養(yǎng)物中豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測(cè)；

同時(shí)適用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典型、高致病性、類NADC30型三種基因亞型的分型檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）適用于本文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫。

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

SN/T1193基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

3縮略語(yǔ)

PRRSV:porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，豬繁殖與呼吸綜合征病毒

LAMP：loop-mediatedisothermalamplification,環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增

RT-LAMP：Reversetranscription,loop-mediatedisothermalamplification，反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增。

4原理

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）主要引起豬繁殖與呼吸綜合征(俗稱藍(lán)耳病)。該病毒有美洲

型和歐洲型兩個(gè)血清型。美洲型又有多個(gè)基因亞型。我國(guó)流行的美洲型PRRSV主要有傳統(tǒng)型、高致病

性和類NADC30型毒株，其主要區(qū)別存在于病毒的Nsp2基因。環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）是一種體

外恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，用于快速檢測(cè)DNA。RT-LAMP是一種逆轉(zhuǎn)錄LAMP，用于檢測(cè)RNA。本標(biāo)準(zhǔn)

RT-LAMP，根據(jù)PRRSV開(kāi)放閱讀框架7（ORF7）基因序列、ORF1a（非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2）基因序列設(shè)

計(jì)4組引物，建立4種RT-LAMP檢測(cè)方法（即LAMP1、LAMP2、LAMP3和LAMP4)，其中LAMP1

的特異性引物識(shí)別ORF7基因，LAMP2、LAMP3和LAMP4的特異性引物識(shí)別Nsp2基因。每種LAMP

引物均包括兩對(duì)內(nèi)、外引物（內(nèi)引物FIP與BIP，外引物F3與B3）和一對(duì)環(huán)引物（LF與LB）。利用

Bst酶啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，通過(guò)在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)狀結(jié)構(gòu)

的莖環(huán)DNA混合物，在恒溫條件下完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的

Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物（焦磷酸鎂）形成白色沉淀，加入顯色液，即可通過(guò)顏色變化觀察判定結(jié)果。

該檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快速、敏感特異，不需要昂貴的儀器設(shè)備。

1

DB32/T3775—2020

5試劑和儀器設(shè)備

5.1試劑要求

除有特殊說(shuō)明外，所有生化試劑均為分析純。RNA提取相關(guān)試劑或用品均需經(jīng)無(wú)RNA酶處理。

5.2引物

PRRSVLAMP檢測(cè)引物和PRRSV毒株基因亞型鑒別LAMP引物，人工合成（基因序列見(jiàn)附錄B.1）。

5.3通用試劑

裂解液（TRIZOL）；氯仿；0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2）（見(jiàn)附錄A.1）；DEPC處理水（見(jiàn)

附錄A.2）；異丙醇；75%乙醇；耐熱M-MLV（RNaseH-）反轉(zhuǎn)錄酶；pMD18-T載體；膠回收試劑盒（Qiagen）；

質(zhì)粒DNA提取試劑盒（TaKaRa）；PCR試劑（Promega）。

5.4LAMP試劑

——10×BstDNA聚合酶緩沖液（見(jiàn)附錄A.3）；

——100mmol/LMgSO4；

——10mmol/LdNTPs（dATP,dCTP,dTTP,dGTP)；

——8U/μLBstDNA聚合酶；

——5mol/L甜菜堿（Betaine）；

——滅菌雙蒸水。

——SYBRGreenI染料，1000×。

5.5陰性及陽(yáng)性對(duì)照

5.5.1陰性對(duì)照

pMD18-T空載體質(zhì)粒。

5.5.2陽(yáng)性對(duì)照

LAMP1陽(yáng)性對(duì)照為pMD-BB-N質(zhì)粒（含高致病性PRRSVBB0907毒株ORF7基因）；LAMP2陽(yáng)性對(duì)

照為pMD-S1-Nsp2質(zhì)粒（含傳統(tǒng)型PRRSVS1毒株Nsp2基因）；LAMP3陽(yáng)性對(duì)照為pMD-BB-Nsp2質(zhì)粒（含

高致病性PRRSVBB0907毒株Nsp2基因）；LAMP4陽(yáng)性對(duì)照為pMD-FJ-Nsp2質(zhì)粒（含類NADC30PRRSV

FJ1402毒株Nsp2基因）。

5.6儀器

高速冷凍離心機(jī)，恒溫水浴鍋，微量移液器（0.5μL～10μL、20μL～200μL、100μL～1000μL），

PCR儀，EP反應(yīng)管（0.5mL、1.5mL），組織勻漿器或研缽。

6檢測(cè)程序

6.1樣品處理

按照NY/T541動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣方法，采集待檢豬的肺臟、脾臟和血清等樣品。肺臟、脾

臟取約1g，剪碎后按1:3（V/V）加入PBS（0.01mol/L，pH7.2），充分勻漿呈懸液。血清制備方法為：血

2

DB32/T3775—2020

液（不加抗凝劑）室溫靜置2h~3h后，4000r/min離心5min，取上清液置于EP管內(nèi)。處理好的勻漿懸

液和血清于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品RNA制備按照經(jīng)驗(yàn)證的RNA提取方法或等效的商品化RNA提取試劑盒，按照其使用說(shuō)明操

作。提取的RNA應(yīng)在2h內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6.2反轉(zhuǎn)錄（cDNA的合成）

配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系19μL，含M-MLV5×Reactionbuffer（含Mg2+）4μL；2.5mol/LdNTPs1μL；

Olige（dT）1μL，RNA酶抑制劑0.5μL；DEPCddH2O5.5μL,RNA7μL，70℃水浴5min后置冰上冷

卻至37℃，再加入1.0μL反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，42℃水浴1h得cDNA，用于下面LAMP擴(kuò)增，或-20℃

凍存?zhèn)溆谩?/p>

6.3LAMP檢測(cè)方法

6.3.1反應(yīng)體系

采用四管兩步RT-LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行。

第一步（1管）：采用LAMP1通用引物（見(jiàn)附錄B.1），檢測(cè)所有PRRSV毒株。

第二步（3管）：對(duì)第一步檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣本，采用LAMP2、LAMP3和LAMP4引物（見(jiàn)附錄B.1），

用3個(gè)EP管，同時(shí)進(jìn)行LAMP，鑒別不同基因亞型PRRSV。

四個(gè)反應(yīng)管反應(yīng)體系相同，總體積25μL，具體反應(yīng)體系如下：

10×BstDNA聚合酶緩沖液（見(jiàn)附錄A.3）2.5μL

MgSO4（4μmol/L）1.5μL

2.5mMdNTPs3.5μL

甜菜堿（Betaine）2.0μL

外引物F3/B3（4μmol/L）各1.0μL

內(nèi)引物FIP/BIP（40μmol/L）各1.0μL

環(huán)引物L(fēng)F/LB（10μmol/L）各1.0μL

BstDNA聚合酶(8U)1.0μL

耐熱M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1.0μL

cDNA模板1.5μL

雙蒸水6.0μL

總計(jì)

25μL

但其中的引物不同，分別是LAMP1、LAMP2、LAMP3和LAMP4引物（見(jiàn)附錄B.1）。每次檢測(cè)應(yīng)分

別設(shè)立陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣品管。LAMP1陽(yáng)性對(duì)照為pMD-BB-N，LAMP2陽(yáng)性對(duì)照為pMD-S1-Nsp2，

LAMP3陽(yáng)性對(duì)照為pMD-BB-Nsp2，LAMP4陽(yáng)性對(duì)照為pMD-FJ-Nsp2質(zhì)粒DNA，陰性對(duì)照為pMD18-T空

載體質(zhì)粒DNA。

在EP管的管蓋上滴加1000×SYBRGreenⅠ染料1.0μL，再輕輕地把蓋子蓋緊。

6.3.2反應(yīng)條件

將反應(yīng)管混勻，置64±1℃擴(kuò)增40min且保證管蓋上的SYBRGreenI不進(jìn)入反應(yīng)物。

3

DB32/T3775—2020

7結(jié)果判定

7.1PRRSV陰陽(yáng)性判定

反應(yīng)結(jié)束后，將LAMP1反應(yīng)管12000r/min，離心1min，輕輕混勻，觀察顏色變化，綠色為陽(yáng)性，

淡黃色為陰性。

7.2PRRSV基因亞型的類型判定

在陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照符合時(shí)，判定樣品檢測(cè)結(jié)果（參見(jiàn)附錄B.2）。

若LAMP1結(jié)果為陽(yáng)性，則判定是PRRSV陽(yáng)性，否則判定為PRRSV陰性。

若LAMP2檢測(cè)為陽(yáng)性，LAMP3、LAMP4檢測(cè)為陰性，則判定是PRRSV經(jīng)典型毒株。

若LAMP3檢測(cè)為陽(yáng)性，LAMP2、LAMP4檢測(cè)為陰性，則判定是PRRSV高致病性毒株。

若LAMP4檢測(cè)為陽(yáng)性，LAMP2、LAMP3檢測(cè)為陰性，則判定是PRRSV類NADC30型毒株。

8安全和防污染措施

8.1檢測(cè)廢棄物等實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)按GB19489和SN/T1193的規(guī)定執(zhí)行。

8.2檢測(cè)過(guò)程中防止污染措施按GB/T27401的規(guī)定執(zhí)行。

8.3實(shí)驗(yàn)前后，實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒。

4

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

試劑配制

A.10.01mol/L（pH7.2）的磷酸鹽緩沖液（PBS）

A液（0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液）：NaH2PO4·2H2O27.6g，先用適量蒸餾水溶解，最后用蒸餾水

稀釋至1000mL。

B液（0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液）：Na2HPO4·12H2O71.6g（或Na2HPO4·2H2O35.6g）先用適量蒸

餾水溶解，最后用蒸餾水稀釋至1000mL。

A液14mL，B液36mL，加氯化鈉（NaCl）8.5g，最后用蒸餾水定容至1000mL；121℃，15min

高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.2DEPC處理水

用0.1%DEPC處理后的蒸餾水（DEPC與蒸餾水1:1000混合），經(jīng)121℃15min高壓處理，用于溶

解RNA。

A.310×BstDNA聚合酶緩沖液

含200mmol/LTris-HCl，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，1%Triton-100，

pH8.8，25℃保存。

5

DB32/T3775—2020

BB

附錄B

（資料性附錄）

引物序列

B1PRRSVLAMP檢測(cè)引物和PRRSV毒株基因亞型鑒別LAMP引物序列，見(jiàn)表B.1。

表B.1LAMP引物序列

引物種類引物名稱序列bp

通用引物G-F3AGAAAAACCCGGAGAAGCC140-156

LAMP1G-B3TGCTGAGGGTGATGCTGT352-369

G-FIPACAATTGCCGCTCACTAGGGGTTTTCCATTTCCCTCTTGCGACT157-177

203-223

G-BIPCGCTGGAACTTGTGCCCTGTTTTTGCACAGTATGTTGCGTAGGC258-277

318-337

G-LFGTGATGCCTGACGTCATCTTC178-198

G-LBGGGAGGATAAGTTACACTGTGGA286-308

BB-NFATGCCAATAATAACGGCAAGCA0-22

RTCATGCTGAGGGTGATGCTGT351-371

經(jīng)典毒株C-F3ACCGCAATGCATCTTCAGG1523-1546

LAMP2C-B3GTCTGTGAGGAAGCAGACAA1723-1743

C-FIPTCGGCTCACTCAAGGGTGTCATTTTAGTGAGCCGGCTCCAATT1561-1578

1611-1619

C-BIPGCACCGCGGCGTAAGTTTCATTTTGTTCTGGTACGGTGGGATTG1642-1662

1692-1711

C-LBGCAGGTGAAAAGATTGAGTTCGGC1664-1686

S1-Nsp2FAGCTGGTGATTGTGTCCTCA1500-1520

RCTCTACTCCCAGAACGCCCCC1780-1800

高致病性毒H-F3TTGAGGCGGCGAATCAGA887-905

株LAMP3H-B3CCAGGACAACCTCTTCCAAC1077-1096

H-FIPCCTTGCCCAAAGGCTCTTGAGTTTTTAACCGGACAACCTCACGT906-923

955-976

H-BIPTGACCGCCTTCTCACTGTCCATTTTCCTCTCACGGTGATGAACCT988-1008

1037-1054

H-LFCAGGGTGCAGCATGAGTTG925-943

H-LBTGCTATTACCCTGCACAAGGTG1012-1033

BB-Nsp2FTTGAGGAATGCTTGGCCAA800-818

RTCGACCTGCTCAGCCGCCCGGGCCA1126-1250

類NADC30N-F3TTGTGCTTCCTGGGGTTG871-891

毒株LAMP4N-B3AACTACCACACCTGGACCT1384-1399

N-FIPGCCATGACAGAAACTGGAGCGTTTTTGAGGCTGCTCAAGCAACG893-910

934-957

N-BIPAAGCGGAGTCTGTCAGGAGCCTTTTGATCTTTCTGCGTGGGGC1321-1343

1365-1384

N-LFTGGTTGATAGGGGGCAGTTC912-927

N-LBTCCAGAGAGCAGGCCTCT1343-1363

FJ-Nsp2FTGAAGAATGCTTGGCTAGGCT800-820

RCTACGCTTGACAGGGAGCT1481-1500

6

DB32/T3775—2020

B.2RT-LAMP結(jié)果示圖

RT-LAMP檢測(cè)結(jié)果示圖B.1

圖B.1RT-LAMP檢測(cè)方法染料染色圖

1.陽(yáng)性樣品（+）

2.陽(yáng)性對(duì)照（+）

3.陰性對(duì)照（-）

______________

7

DB32/T3775—2020

目次

前言.........................................................................................................................................................Ⅰ

1范圍...........................................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件.......................................................................................................................................1

3縮略語(yǔ).......................................................................................................................................................1

4原理...........................................................................................................................................................1

5試劑和儀器設(shè)備.......................................................................................................................................2

6操作程序...................................................................................................................................................2

7結(jié)果判定...................................................................................................................................................4

8安全和防污染措施...................................................................................................................................4

附錄A（規(guī)范性附錄）試劑的配制.................................................................................................5

附錄B（資料性附錄）.......................................................................................................................6

I

DB32/T3775—2020

豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-LAMP檢測(cè)方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-LAMP檢測(cè)原理、試劑和儀器設(shè)備、檢測(cè)程序和結(jié)果判

定。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬臨床樣品（肺臟、脾臟和血清）和細(xì)胞培養(yǎng)物中豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測(cè)；

同時(shí)適用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典型、高致病性、類NADC30型三種基因亞型的分型檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）適用于本文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫。

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

SN/T1193基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

3縮略語(yǔ)

PRRSV:porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，豬繁殖與呼吸綜合征病毒

LAMP：loop-mediatedisothermalamplification,環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增

RT-LAMP：Reversetranscription,loop-mediatedisothermalamplification，反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增。

4原理

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）主要引起豬繁殖與呼吸綜合征(俗稱藍(lán)耳病)。該病毒有美洲

型和歐洲型兩個(gè)血清型。美洲型又有多個(gè)基因亞型。我國(guó)流行的美洲型PRRSV主要有傳統(tǒng)型、高致病

性和類NADC30型毒株，其主要區(qū)別存在于病毒的Nsp2基因。環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）是一種體

外恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，用于快速檢測(cè)DNA。RT-LAMP是一種逆轉(zhuǎn)錄LAMP，用于檢測(cè)RNA。本標(biāo)準(zhǔn)

RT-LAMP，根據(jù)PRRSV開(kāi)放閱讀框架7（ORF7）基因序列、ORF1a（非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2）基因序列設(shè)

計(jì)4組引物，建立4種RT-LAMP檢測(cè)方法（即LAMP1、LAMP2、LAMP3和LAMP4)，其中LAMP1

的特異性引物識(shí)別ORF7基因，LAMP2、LAMP3和LAMP4的特異性引物識(shí)別Nsp2基因。每種LAMP

引物均包括兩對(duì)內(nèi)、外引物（內(nèi)引物FIP與BIP，外引物F3與B3）和一對(duì)環(huán)引物（LF與LB）。利用

Bst酶啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，通過(guò)在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)狀結(jié)構(gòu)

的莖環(huán)DNA混合物，在恒溫條件下完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的

Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物（焦磷酸鎂）形成白色沉淀，加入顯色液，即可通過(guò)顏色變化觀察判定結(jié)果。

該檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快速、敏感特異，不需要昂貴的儀器設(shè)備。

1

DB32/T3775—2020

5試劑和儀器設(shè)備

5.1試劑要求

除有特殊說(shuō)明外，所有生化試劑均為分析純。RNA提取相關(guān)試劑或用品均需經(jīng)無(wú)RNA酶處理。

5.2引物

PRRSVLAMP檢測(cè)引物和PRRSV毒株基因亞型鑒別LAMP引物，人工合成（基因序列見(jiàn)附錄B.1）。

5.3通用試劑

裂解液（TRIZOL）；氯仿；0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2）（見(jiàn)附錄A.1）；DEPC處理水（見(jiàn)

附錄A.2）；異丙醇；75%乙醇；耐熱M-MLV（RNaseH-）反轉(zhuǎn)錄酶；pMD18-T載體；膠回收試劑盒（Qiagen）；

質(zhì)粒DNA提取試劑盒（TaKaRa）；PCR試劑（Promega）。

5.4LAMP試劑

——10×BstDNA聚合酶緩沖液（見(jiàn)附錄A.3）；

——100mmol/LMgSO4；

——10mmol/LdNTPs（dATP,dCTP,dTTP,dGTP)；

——8U/μLBstDNA聚合酶；

——5mol/L甜菜堿（Betaine）；

——滅菌雙蒸水。

——SYBRGreenI染料，1000×。

5.5陰性及陽(yáng)性對(duì)照

5.5.1陰性對(duì)照

pMD18-T空載體質(zhì)粒。

5.5.2陽(yáng)性對(duì)照

LAMP1陽(yáng)性對(duì)照為pMD-BB-N質(zhì)粒（含高致病性PRRSVBB0907毒株ORF7基因）；LAMP2陽(yáng)性對(duì)

照為pMD-S1-Nsp2質(zhì)粒（含傳統(tǒng)型PRRSVS1毒株Nsp2基因）；LAMP3陽(yáng)性對(duì)照為pMD-BB-Nsp2質(zhì)粒（含

高致病性PRRSVBB0907毒株Nsp2基因）；LAMP4陽(yáng)性對(duì)照為pMD-FJ-Nsp2質(zhì)粒（含類NADC30PRRSV

FJ1402毒株Nsp2基因）。

5.6儀器

高速冷凍離心機(jī)，恒溫水浴鍋，微量移液器（0.5μL～10μL、20μL～200μL、100μL～1000μL），

PCR儀，EP反應(yīng)管（0.5mL、1.5mL），組織勻漿器或研缽。

6檢測(cè)程序

6.1樣品處理

按照NY/T541動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣方法，采集待檢豬的肺臟、脾臟和血清等樣品。肺臟、脾

臟取約1g，剪碎后按1:3（V/V）加入PBS（0.01mol/L，pH7.2），充分勻漿呈懸液。血清制備方法為：血

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DB32/T3775—2020

液（不加抗凝劑）室溫靜置2h~3h后，4000r/min離心5min，取上清液置于EP管內(nèi)。處理好的勻漿懸

液和血清于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品RNA制備按照經(jīng)驗(yàn)證的RNA提取方法或等效的商品化RNA提取試劑盒，按照其使用說(shuō)明操

作。提取的RNA應(yīng)在2h內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6.2反轉(zhuǎn)錄（cDNA的合成）

配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系19μL，含M-MLV5×Reactionbuffer（含Mg2+）4μL；2.5mol/LdNTPs1μL；

Olige（dT）1μL，RNA酶抑制劑0.5μL；DEPCddH2O5.5μL,RNA7μL，70℃水浴5min后置冰上冷

卻至37℃，再加入1.0μL反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，42℃水浴1h得cDNA，用于下面LAMP擴(kuò)增，或-20℃

凍存?zhèn)溆谩?/p>

6.3LAMP檢測(cè)方法

6.3.1反應(yīng)體系

采用四管兩步RT-LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行。

第一步（1管）：采用LAMP1通用引物（見(jiàn)附錄B.1），檢測(cè)所有PRRSV毒株。

第二步（3管）：對(duì)第一步檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣本，采用LAMP2、LAMP3和LAMP4引物（見(jiàn)附錄B.1），

用3個(gè)EP管，同時(shí)進(jìn)行LAMP，鑒別不同基因亞型PRRSV。

四個(gè)反應(yīng)管反應(yīng)體系相同，總體積25μL，具體反應(yīng)體系如下：

10×BstDNA聚合酶緩沖液（見(jiàn)附錄A.3）2.5μL